Визуализация морфологических характеристик нервно-мышечного соединения в медиальной икроножной мышце крысы
Summary
Протокол показывает метод изучения пространственной корреляции между пресинаптическими терминалами, постсинаптическими рецепторами и перисинаптическими шванновскими клетками в медиальной икроножной мышце крыс с использованием флуоресцентной иммуногистохимии с различными биомаркерами, а именно нейрофиламентом 200, везикулярным транспортером ацетилхолина, альфа-бунгаротоксином и S100.
Abstract
Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой сложную структуру, служащую для передачи сигнала от двигательного нейрона к скелетной мышце, и состоит из трех основных гистологических компонентов: пресинаптических моторных аксонных терминалов, постсинаптических никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (AchRs) и перисинаптических шванновских клеток (PSC). Чтобы продемонстрировать морфологические характеристики NMJ, медиальную икроножную мышцу крысы выбирали в качестве ткани-мишени и исследовали с использованием множественного флуоресцентного окрашивания различными видами биомаркеров, включая нейрофиламент 200 (NF200) и везикулярный транспортер ацетилхолина (VAChT) для двигательных нервных волокон и их пресинаптических терминалей, альфа-бунгаротоксин (α-BTX) для постсинаптических никотиновых AchRs, и S100 для ЦОНов. В этом исследовании окрашивание проводилось в двух группах: в первой группе образцы окрашивали NF200, VAChT и α-BTX, а во второй группе образцы окрашивали NF200, α-BTX и S100. Было показано, что оба протокола могут эффективно продемонстрировать детальную структуру NMJ. С помощью конфокального микроскопа были просмотрены морфологические характеристики пресинаптических терминалей, постсинаптических рецепторов и PSC, а их изображения Z-стеков были реконструированы в трехмерном виде для дальнейшего анализа пространственной корреляции между различными маркировками. С точки зрения методологии, эти протоколы обеспечивают ценный справочник для исследования морфологических характеристик NMJ в физиологических условиях, которые также могут быть подходящими для оценки патологического изменения NMJ, такого как повреждение периферических нервов и регенерация.
Introduction
В качестве трех основных структурных компонентов нервно-мышечного соединения (NMJ)1,2,3,4 широко исследованы морфологические аспекты пресинаптических моторных терминалей аксонов, постсинаптическая мембрана, содержащая никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (AchRs), и перисинаптические шванновские клетки (PSC). Тонкие срезы и цельные образцы скелетных мышц были исследованы с помощью различных гистологических методов, таких как электронная микроскопия 5,6, конфокальная микроскопия 7,8 и микроскопия светового листа 9,10. Хотя морфологические характеристики NMJ были продемонстрированы этими методами с разных сторон, для сравнения, конфокальная микроскопия по-прежнему является идеальным выбором для визуализации подробной морфологии NMJ.
В последнее время было разработано много новых технологий для демонстрации структурных компонентов NMJ. Например, трансгенные флуоресцентные мыши thy1-YFP были непосредственно использованы для наблюдения моторных аксонов и концевых пластин двигателя in vivo и in vitro10,11. Кроме того, внутривенная инъекция флуоресцентных α-BTX была применена для выявления пространственного распределения моторных концевых пластин в цельномонтных скелетных мышцах диких и трансгенных флуоресцентных мышей с использованием оптического очистителя тканей для обследования с помощью микроскопии светового листа 9,12. Однако, помимо пре- и постсинаптических элементов, которые могут быть просмотрены этими передовыми методами, PSC не могут быть продемонстрированы одновременно.
Накопленные данные свидетельствуют о том, что PSC, как периферические глиальные клетки, тесно связаны с пресинаптическими терминалями, способствующими развитию и стабильности NMJ, модуляции синаптической активности NMJ в физиологическом состоянии и регенерации NMJ после повреждения нерва 13,14,15 . Учитывая клеточную архитектуру NMJ, этот протокол является подходящим кандидатом для одновременной маркировки PSC, пре- и постсинаптических элементов и потенциально используется для оценки целостности и пластичности NMJ в нормальных и патологических условиях. Например, сравните интенсивность НМЮ, морфологию и объем постсинаптических двигательных концевых пластин, иннервацию и денервацию НМЮ, а также количество ПСК в мышцах физиологического и патологического статуса.
Икроножная мышца является самой большой мышцей, образующей выпуклость в икре, которая легко рассекается путем удаления кожи и мышцы бицепса бедра из конечности. Мышца часто выбирается для оценки мышечной атрофии, нервно-мышечной дегенерации, мышечной производительности и силы двигательной единицы ex vivo или in vivo 16,17,18. Тем не менее, методика также подходит для выявления морфологических характеристик NMJ из различных скелетных мышц. В то же время толстые мышечные участки могут выявить более полную морфологию и количество NMJ по сравнению с тонкими срезами 7,8 и дразнящими мышечными волокнами19.
В соответствии с этими исследованиями медиальная икроножная мышца крысы была выбрана в качестве ткани-мишени в этом исследовании и была разрезана на толщину 80 мкм для многократного флуоресцентного окрашивания различными видами биомаркеров в соответствии со структурными компонентами NMJ. Здесь нейрофиламент 200 (NF200)20,21, везикулярный транспортер ацетилхолина (VAChT)22, альфа-бунгаротоксин (α-BTX)23,24 и S10025,26 использовались для маркировки нервных волокон, пресинаптических окончаний, постсинаптических АхР и PSC соответственно. Кроме того, фон мышечной ткани и клеточных ядер был дополнительно уравновешен фаллоидином и DAPI.
В этом исследовании мы ожидаем разработать усовершенствованный протокол одновременного окрашивания клеточной архитектуры NMJ соответствующими биомаркерами на более толстых фиксированных образцах, что более удобно для использования в конфокальной микроскопии и помогает получить гораздо больше информации о детальной структуре PSC, пре- и постсинаптических элементах, а также их пространственной корреляции друг с другом. С точки зрения методологии, этот протокол может быть полезен для оценки морфологических характеристик NMJ при нормальных и патологических состояниях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описаны технические детали, необходимые для успешного многократного окрашивания мышечных срезов и использования флуоресцентной иммуногистохимии для выявления морфологических характеристик NMJ на толстых участках медиальной икроножной мышцы крысы. Используя этот подход, мелкие дета…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Инновационным фондом CACMS (No. CI2021A03407), Национальный фонд естественных наук Китая (No 82004299) и Фонды фундаментальных исследований для Центральных научно-исследовательских институтов общественного благосостояния (No. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
- Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
- Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
- Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
- Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
- Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
- Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
- Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells – The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
- Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
- Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
- Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
- Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
- Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
- Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
- Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
- Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).
- Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
- Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
- Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. Molecular architecture of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
