Sıçan Medial Gastroknemius Kasında Nöromüsküler Kavşağın Morfolojik Özelliklerinin Görselleştirilmesi
Summary
Protokol, sıçan medial gastroknemius kasındaki pre-sinaptik terminaller, post-sinaptik reseptörler ve peri-sinaptik Schwann hücreleri arasındaki uzamsal korelasyonu, farklı biyobelirteçlerle, yani nörofilament 200, veziküler asetilkolin taşıyıcısı, alfa-bungarotoksin ve S100 ile floresan immünohistokimya kullanarak incelemek için bir yöntem göstermektedir.
Abstract
Nöromüsküler bileşke (NMJ), motor nörondan iskelet kasına sinyal iletişimi için hizmet eden karmaşık bir yapıdır ve üç temel histolojik bileşenden oluşur: sinaptik öncesi motor akson terminalleri, sinaptik sonrası nikotinik asetilkolin reseptörleri (AchR’ler) ve peri-sinaptik Schwann hücreleri (PSC’ler). NMJ’nin morfolojik özelliklerini göstermek için, sıçan medial gastroknemius kası hedef doku olarak seçildi ve motor sinir lifleri ve bunların pre-sinaptik terminalleri için nörofilament 200 (NF200) ve veziküler asetilkolin taşıyıcı (VAChT), post-sinaptik nikotinik AchR’ler için alfa-bungarotoksin (α-BTX) dahil olmak üzere çeşitli biyobelirteçlerle çoklu floresan boyama kullanılarak incelendi. ve PSC’ler için S100. Bu çalışmada boyama iki grupta yapıldı: Birinci grupta örnekler NF200, VAChT ve α-BTX ile boyandı ve ikinci grupta örnekler NF200, α-BTX ve S100 ile boyandı. Her iki protokolün de NMJ’nin ayrıntılı yapısını etkili bir şekilde gösterebileceği gösterilmiştir. Konfokal mikroskop kullanılarak, sinaptik öncesi terminallerin, post-sinaptik reseptörlerin ve PSC’nin morfolojik özellikleri görüldü ve Z-yığınları görüntüleri, farklı etiketlemeler arasındaki uzamsal korelasyonu daha fazla analiz etmek için üç boyutlu bir desende yeniden yapılandırıldı. Metodoloji perspektifinden bakıldığında, bu protokoller fizyolojik koşullar altında NMJ’nin morfolojik özelliklerini araştırmak için değerli bir referans sağlar ve bu da periferik sinir hasarı ve rejenerasyon gibi NMJ’nin patolojik değişikliğini değerlendirmek için uygun olabilir.
Introduction
Nöromüsküler bileşke (NMJ)1,2,3,4’ün üç temel yapısal bileşeni olarak, sinaptik öncesi motor akson terminallerinin, nikotinik asetilkolin reseptörleri (AchR’ler) içeren post-sinaptik membranın ve peri-sinaptik Schwann hücrelerinin (PSC’ler) morfolojik yönleri kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. İskelet kaslarının ince kesitleri ve tam montajlı örnekleri, elektron mikroskobu 5,6, konfokal mikroskopi 7,8 ve ışık tabakası mikroskobu 9,10 gibi farklı histolojik tekniklerle incelenmiştir. NMJ’nin morfolojik özellikleri bu tekniklerle farklı yönlerden gösterilmiş olsa da, karşılaştırma olarak, konfokal mikroskopi, NMJ’nin ayrıntılı morfolojisinin görüntülenmesi için hala ideal bir seçimdir.
Son zamanlarda, NMJ’nin yapısal bileşenlerini göstermek için birçok yeni teknoloji geliştirilmiştir. Örneğin, thy1-YFP transgenik floresan fareleri, motor aksonları ve motor uç plakalarını in vivo ve in vitro 10,11’i gözlemlemek için doğrudan kullanılmıştır. Ek olarak, floresan α-BTX’in intravenöz enjeksiyonu, ışık tabakası mikroskobu 9,12 ile inceleme için doku optik temizleme tedavisi kullanılarak, vahşi tip ve transgenik floresan farelerin tüm montajlı iskelet kaslarındaki motor uç plakalarının mekansal dağılımını ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu gelişmiş yöntemlerle görülebilen sinaptik öncesi ve sonrası elemanların yanı sıra, PSC’ler aynı anda gösterilemez.
Biriken kanıtlar, PSC’lerin, periferik glial hücreler olarak, NMJ’nin gelişimine ve stabilitesine, fizyolojik durum altında NMJ’nin sinaptik aktivitesinin modülasyonuna ve sinir hasarından sonra NMJ’nin rejenerasyonuna katkıda bulunan pre-sinaptik terminallerle yakından ilişkili olduğunu göstermektedir13,14,15 . NMJ’nin hücresel mimarisi göz önüne alındığında, bu protokol PSC’leri, sinaptik öncesi ve sonrası elemanları aynı anda etiketlemek için uygun bir adaydır ve NMJ’nin bütünlüğünü ve plastisitesini normal ve patolojik koşullar altında değerlendirmek için potansiyel olarak kullanılır. Örneğin, NMJ’nin yoğunluğunu, post-sinaptik motor uç plakalarının morfolojisini ve hacmini, NMJ’nin innervasyonu ve denervasyonunu ve fizyolojik ve patolojik durumdaki kaslardaki PSC’lerin sayısını karşılaştırın.
Gastroknemius kası, baldırdaki şişkinliği oluşturan en büyük kastır ve cildin ve biseps femoris kasının uzuvdan çıkarılmasıyla kolayca diseke edilir. Kas genellikle kas atrofisi, nöromüsküler dejenerasyon, kas performansı ve motor ünite kuvveti ex vivo veya in vivo16,17,18’i değerlendirmek için seçilir. Bununla birlikte, teknik, NMJ’nin morfolojik özelliklerini çeşitli iskelet kaslarından ortaya çıkarmak için de uygundur. Aynı zamanda, kalın kas bölümleri, ince bölümler 7,8 ve alaylı kas lifleri19’a kıyasla daha eksiksiz bir morfoloji ve NMJ miktarı ortaya çıkarabilir.
Bu çalışmalar doğrultusunda, bu çalışmada sıçan medial gastroknemius kası hedef doku olarak seçilmiş ve NMJ’nin yapısal bileşenlerine göre çeşitli biyobelirteçlerle çoklu floresan boyama için 80 μm kalınlığında dilimlenmiştir. Burada, sinir liflerini, sinaptik öncesi terminalleri, post-sinaptik AchR’leri ve PSC’leri etiketlemek için sırasıyla nörofilament 200 (NF200) 20,21, veziküler asetilkolin taşıyıcı (VAChT) 22, alfa-bungarotoksin (α-BTX)23,24 ve S100 25,26 kullanıldı. Ek olarak, kas dokusunun ve hücresel çekirdeklerin arka planı falloidin ve DAPI ile daha da boyandı.
Bu çalışmada, NMJ’nin hücresel mimarisini, daha kalın sabit örnekler üzerinde karşılık gelen biyobelirteçlerle aynı anda boyamak için rafine bir protokol geliştirmeyi bekliyoruz; bu, konfokal mikroskopide kullanım için daha uygundur ve PSC’lerin ayrıntılı yapısı, sinaptik öncesi ve sonrası elemanlar ve birbirleriyle uzamsal korelasyonları hakkında çok daha fazla bilgi edinmeye yardımcı olur. Metodoloji açısından bakıldığında, bu protokol normal ve patolojik koşullar altında NMJ’nin morfolojik özelliklerini değerlendirmek için yararlı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kas dilimlerinin başarılı çoklu boyanması ve sıçan medial gastroknemius kasının kalın kesitlerinde NMJ’nin morfolojik özelliklerini ortaya çıkarmak için floresan immünohistokimyasının kullanılması için gerekli teknik detayları açıkladık. Bu yaklaşımı kullanarak, PSC’lerin ve sinaptik öncesi ve sonrası elemanların ince detayları ve mekansal korelasyonu, konfokal mikroskopi altında analiz edilebilir ve takdir edilebilir ve üç boyutlu bir düzende yeniden yapılandırılabilir. Burada, NMJ’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma CACMS İnovasyon Fonu (No. CI2021A03407), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82004299) ve Merkezi Kamu Refahı Araştırma Enstitüleri için Temel Araştırma Fonları (No. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
- Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
- Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
- Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
- Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
- Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
- Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
- Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells – The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
- Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
- Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
- Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
- Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
- Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
- Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
- Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
- Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).
- Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
- Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
- Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. Molecular architecture of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
