Summary

Genç Yetişkin ve Yaşlı Gerbil Cochleae'de İmmünoetiketleme ve Şerit Sinapslarının Sayılması

Published: April 21, 2022
doi:

Summary

Genç erişkin ve yaşlı gerbil kokleae’lerin afferent sinaptik yapıların ve saç hücrelerinin immüno-etiketlenmesi, yaşlı dokudaki otofloresansın söndürülmesi, kokleae’nin uzunluğunun diseksiyonu ve tahmin edilmesi ve konfokal görüntüleme ile elde edilen görüntü yığınlarındaki sinapsların nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

İç saç hücrelerini ve afferent işitme siniri liflerini birbirine bağlayan şerit sinapsların kaybı, yaşa bağlı işitme kaybının bir nedeni olarak kabul edilir. Şerit sinapslarının kaybını tespit etmek için en yaygın yöntem immünoetiketlemedir, çünkü bireysel bir kokleadaki çeşitli tonotopik konumlardan kantitatif örneklemeye izin verir. Bununla birlikte, ilgilenilen yapılar kemikli kokleanın derinliklerine gömülüdür. Gerbiller, yaşa bağlı işitme kaybı için bir hayvan modeli olarak kullanılır. Burada, fiksasyon, gerbil koklear bütün montajların immüno-etiketlenmesi, konfokal görüntüleme ve şerit sinaps sayılarının ve hacimlerinin ölçülmesi için rutin protokoller açıklanmaktadır. Ayrıca, değerli yaşlanan bireylerden iyi malzeme elde etmekle ilgili özel zorluklar vurgulanmaktadır.

Gerbiller ötenazi yapılır ve ya kardiyovasküler olarak perfüze edilir ya da timpanik bülleri kafatasından dikkatlice diseke edilir. Koklealar tepe ve tabanda açılır ve doğrudan fiksatif bölgeye aktarılır. İlk yöntemden bağımsız olarak, koklealar sonradan sabitlenir ve daha sonra kireçten arındırılır. Doku daha sonra sinaptik öncesi ve sonrası yapılara ve saç hücrelerine karşı birincil antikorlarla etiketlenir. Daha sonra, kokleae, kendi birincil antikorlarına karşı spesifik olan ikincil floresan etiketli antikorlarla inkübe edilir. Yaşlı gerbillerin kokleaları daha sonra yaşlı hayvanların dokularının tipik olarak önemli arka plan floresansını azaltmak için bir otofloresan söndürücü ile muamele edilir.

Son olarak, koklealar 6-11 segmente ayrılır. Tüm koklear uzunluk, belirli koklear konumların bireyler arasında güvenilir bir şekilde belirlenebileceği şekilde yeniden yapılandırılır. Sırayla elde edilen konfokal görüntü yığınları, seçilen konumlardaki saç hücrelerini ve sinapsları görselleştirmeye yardımcı olur. Konfokal yığınlar deconvolved edilir ve sinapslar ya ImageJ kullanılarak manuel olarak sayılır ya da Matlab’da özel olarak yazılmış görüntü analizi prosedürleri ile sinaptik yapıların daha kapsamlı bir şekilde ölçülmesi gerçekleştirilir.

Introduction

Yaşa bağlı işitme kaybı, 65 yaş ve üstü dünya nüfusunun üçte birinden fazlasını etkileyen, dünyanın en yaygın hastalıklarından biridir1. Altta yatan nedenler hala tartışılmakta ve aktif olarak araştırılmaktadır, ancak iç saç hücrelerini (IHC’ler) afferent işitme siniri lifleri ile bağlayan özel sinapsların kaybını içerebilir2. Bu şerit sinapslar, kendisine bağlı nörotransmitter glutamat ile dolu veziküllerin yanı sıra postsinaptik α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) glutamat reseptörleri 3,4,5 olan presinaptik bir yapıyı içerir. Gerbilde, ~ 20 afferent işitme siniri lifi bir IHC 6,7,8 ile temas eder. IHC’deki modiolusa bakan lifler büyük sinaptik şeritlere karşıyken, IHC’nin sütun tarafına bağlanan lifler küçük sinaptik şeritlerle karşı karşıya kalır (yani, kedilerde9, gerbiller7, gine domuzları 10 ve farelerde 3,11,12,13,14). Ayrıca gerbilde presinaptik şeritlerin ve postsinaptik glutamat yamalarının büyüklüğü pozitif korelasyongösterir 7,14. IHC’nin modiolar tarafındaki büyük şeritlere karşı çıkan lifler kalibre olarak küçüktür ve düşük spontan oranlara ve yüksek eşiklere sahiptir15. Düşük spontan oranlı liflerin, gürültüye maruz kalma 10 ve ototoksik ilaçlara karşı16, IHC15’in sütun tarafında bulunan yüksek spontan düşük eşikli liflerden daha savunmasız olduğuna dair kanıtlar vardır.

Şerit sinapslarının kaybı, koklear nöral yaşa bağlı işitme kaybında en erken dejeneratif olaydır, spiral ganglion hücrelerinin ve bunların afferent işitme siniri liflerinin kaybı 17,18’in gerisinde kalmaktadır. Elektrofizyolojik korelasyonlar, işitsel beyin sapı yanıtlarınınkayıtlarını içerir 17 ve bileşik aksiyon potansiyelleri8; Bununla birlikte, bunlar sinaps kaybının inceliklerini yansıtmaz, çünkü düşük spontan oranlı lifler bu önlemlere katkıda bulunmaz16. Daha umut verici elektrofizyolojik metrikler, kütle potansiyelinden türetilmiş nöral indeks19 ve peristimulus zaman yanıtı20’dir. Bununla birlikte, bunlar yalnızca hayvanın işitme siniri lifi kaybının ötesinde, kalan işitme siniri liflerinin aktivitesini etkileyen başka koklear patolojileri yoksa güvenilirdir8. Ayrıca, gerbildeki davranışsal olarak değerlendirilen eşikler sinaps sayıları21 ile ilişkili değildi. Bu nedenle, hayatta kalan şerit sinapslarının ve dolayısıyla fonksiyonel işitme siniri liflerinin sayısının güvenilir bir şekilde ölçülmesi ancak koklear dokunun doğrudan incelenmesiyle mümkündür.

Moğol gerbili (Meriones unguiculatus), yaşa bağlı işitme kaybını incelemek için uygun bir hayvan modelidir. Kısa bir ömre sahiptir, insanlara benzer düşük frekanslı işitmeye sahiptir, bakımı kolaydır ve yaşa bağlı işitme kaybıile ilgili insan patolojileriyle benzerlikler gösterir 2,22,23,24. Gerbiller, ortalama yaşam süreleri22’nin sonuna yakın olan 36 aylıkken yaşlı olarak kabul edilir. Daha da önemlisi, yaşa bağlı bir şerit sinaps kaybı, sessiz ortamlarda yetiştirilen ve yaşlanan gerbillerde gösterilmiştir 8,21.

Burada, genç yetişkinlerden yaşlılara kadar farklı yaşlardaki gerbillerden kokleaları immünoetiketlemek, diseke etmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır. Presinapsın (CtBP2), postsinaptik glutamat reseptör yamalarının (GluA2) ve IHC’lerin (myoVIIa) bileşenlerine yönelik antikorlar kullanılır. Yaşlı koklealarda arka planı azaltan ve floresan sinyalini sağlam bırakan bir otofloresan söndürücü uygulanır. Ayrıca, hem duyusal epiteli hem de stria vascularis’i incelemek için kokleanın nasıl diseke edileceğine dair bir açıklama verilmiştir. Koklear uzunluk, belirli en iyi frekanslara karşılık gelen farklı koklear konumların seçilmesini sağlamak için ölçülür25. Sinaps sayılarının nicelleştirilmesi, serbestçe kullanılabilen ImageJ26 yazılımı ile gerçekleştirilir. Bireysel HC içindeki sinaps hacimlerinin ve konumlarının ek nicelleştirilmesi, Matlab’da özel olarak yazılmış yazılımla gerçekleştirilir. Bu yazılım, yazarlar profesyonel dokümantasyon ve destek sağlayacak kaynaklardan yoksun oldukları için kamuya açık hale getirilmemiştir.

Protocol

Tüm protokoller ve prosedürler, AZ 33.19-42502-04-15/1828 ve 33.19-42502-04-15/1990 izin numaralarıyla Almanya’nın Aşağı Saksonya eyaletinin ilgili makamları tarafından onaylanmıştır. Bu protokol her iki cinsiyetten Moğol gerbilleri (M. unguiculatus) içindir. Genç yetişkin 3-12 aylık yaşı ifade ederken, gerbiller 36 ay ve üstü olarak kabul edilir. Aksi belirtilmediğinde, tamponlar ve çözeltiler hazırlanabilir ve buzdolabında birkaç aya kadar (4-8 ° C) saklanabilir. Kullanmadan önce, …

Representative Results

Kokleae, kardiyovasküler perfüzyondan sonra ya tüm hayvanın fiksatif ile hasat edildi ya da hayvanı ötenazi yaptıktan ve daldırma ile sabitlendikten sonra hızla diseke edildi. İkinci yöntemle, IHC’ler diseksiyon sırasında yerinde kalırken, başarısız perfüzyon ve dolayısıyla yetersiz sabit doku durumlarında, duyusal epitel sıklıkla tahrip olmuştur. Yazarların, transkardiyal perfüzyondan sonra kokleaların fiksasyonunun yetersiz olduğu, beynin fiksasyonunun hala yeterli olduğu vakalarla karşıl…

Discussion

Bu protokolde özetlenen yöntemle, koklealardaki IHC’leri ve sinaptik yapıları genç yetişkin ve yaşlı gerbillerden immüno-etiketlemek, sinaptik öncesi ve sonrası elemanların birlikte lokalizasyonu ile varsayılan fonksiyonel sinapsları tanımlamak, bunları bireysel İHC’lere tahsis etmek ve sayılarını, hacimlerini ve konumlarını ölçmek mümkündür. Bu yaklaşımda kullanılan antikorlar ayrıca dış saç hücrelerini (OHC’ler; myoVIIa) ve presinaptik şeritlerini de etiketledi. Ayrıca, hem IHC’ler…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Lichun Zhang’a yöntemin kurulmasına yardımcı olduğu için ve görüntüleme tesislerinin kullanımı için Oldenburg Carl von Ossietzky Üniversitesi, Floresan Mikroskopi Hizmet Birimi’ne teşekkür eder. Bu araştırma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi -EXC 2177/1 kapsamında finanse edilmiştir.

Materials

Albumin Fraction V biotin-free Carl Roth 0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) BD Biosciences, Eysins 612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) Millipore MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488 Molecular Probes Inc. A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) Proteus Biosciences 25e6790
Blade Holder & Breaker – Flat Jaws Fine Science Tools 10052-11
Bonn Artery Scissors – Ball Tip Fine Science Tools 14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm Carl Roth LH26.1
Disposable Surgical Blade Henry Schein 0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 Life Technologies-Molecular Probes A-31573
Dumont #5 – Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Ethanol, absolute 99.8% Fisher Scientific 12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid Carl Roth 8040.2
Excel Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade PLANO 112-9
G19 Cannula Henry Schein 9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 Invitrogen A-21134
Heparin Ratiopharm N68542.04
Huygens Essentials Scientific Volume Imaging
ImageJ Fiji
Immersol, Immersion oil 518F Carl Zeiss 10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) Braun 4062957E
ISM596D Ismatec peristaltic pump
KL 1600 LED Schott 150.600 light source for stereomicroscope
Leica Application suite X Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut Fine Science Tools 14512-17
Mini-100 Orbital-Genie Scientific Industries SI-M100 for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital) Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei Nikon
NIS Elements Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde Carl Roth 0335.3
Petri dish without vents Avantor VWR 390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate AppliChem A1046
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1
Potassium chloride Carl Roth 6781.1
Sodium chloride Sigma Aldrich 31434-M
Screw Cap Containers Sarstedt 75.562.300
Sodium azide Carl Roth K305.1
Student Adson Forceps Fine Science Tools 91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat Fine Science Tools 91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides Epredia J1800AMNZ
Triton  X Carl Roth 3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher Biotium 23007
Vannas Spring Scissors, 3mm Fine Science Tools 15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000
Vibrax VXR basic IKA 0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic IKA 953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) Wild Heerbrugg not available anymore

References

  1. Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
  2. Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
  3. Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
  4. Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
  5. Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
  6. Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
  7. Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
  8. Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
  9. Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
  10. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  11. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  12. Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
  13. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
  14. Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
  15. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  16. Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
  17. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  18. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  19. Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
  20. Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
  21. Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
  22. Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
  23. Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
  24. Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  25. Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
  28. Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
  29. Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
  30. Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
  31. Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
  32. Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
  33. Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
  34. Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
  35. Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).

Play Video

Cite This Article
Steenken, F., Bovee, S., Köppl, C. Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae. J. Vis. Exp. (182), e63874, doi:10.3791/63874 (2022).

View Video