Immunolabeling en counting ribbon synapsen bij jongvolwassen en oude Gerbil Cochleae
Summary
Een protocol voor het verwerken van jongvolwassen en oud gerbil slakkenhuis door immunolabeling van de afferente synaptische structuren en haarcellen, het blussen van autofluorescentie in verouderd weefsel, het ontleden en schatten van de lengte van het slakkenhuis en het kwantificeren van de synapsen in beeldstapels verkregen met confocale beeldvorming wordt gepresenteerd.
Abstract
Het verlies van lintsynapsen die binnenste haarcellen en afferente gehoorzenuwvezels verbinden, wordt verondersteld een oorzaak te zijn van leeftijdsgebonden gehoorverlies. De meest gebruikelijke methode voor het detecteren van het verlies van lintsynapsen is immunolabeling omdat het kwantitatieve bemonstering van verschillende tonotopische locaties in een individueel slakkenhuis mogelijk maakt. De interessante structuren zijn echter diep in het benige slakkenhuis begraven. Gerbils worden gebruikt als diermodel voor leeftijdsgebonden gehoorverlies. Hier worden routinematige protocollen voor fixatie, immunolabeling gerbil cochleaire hele mounts, confocale beeldvorming en het kwantificeren van lint synapsnummers en volumes beschreven. Bovendien worden de specifieke uitdagingen in verband met het verkrijgen van goed materiaal van waardevolle ouder wordende personen benadrukt.
Gerbils worden geëuthanaseerd en ofwel cardiovasculair doordrenkt, of hun trommelvlies bullae worden zorgvuldig uit de schedel ontleed. Het slakkenhuis wordt geopend aan de top en de basis en direct overgebracht naar het fixatief. Ongeacht de initiële methode worden de slakkenhuizen nagefixeerd en vervolgens ontkalkt. Het weefsel wordt vervolgens gelabeld met primaire antilichamen tegen pre- en postsynaptische structuren en haarcellen. Vervolgens worden de slakkenhuizen geïncubeerd met secundaire fluorescentie-gelabelde antilichamen die specifiek zijn tegen hun respectieve primaire antilichamen. Het slakkenhuis van oude gerbils wordt vervolgens behandeld met een autofluorescentie quencher om de typisch substantiële achtergrondfluorescentie van de weefsels van oudere dieren te verminderen.
Ten slotte worden slakkenhuizen ontleed in 6-11 segmenten. De gehele cochleaire lengte wordt zodanig gereconstrueerd dat specifieke cochleaire locaties betrouwbaar kunnen worden bepaald tussen individuen. Confocale beeldstapels, sequentieel verkregen, helpen haarcellen en synapsen op de gekozen locaties te visualiseren. De confocale stapels worden gedeconcentraliseerd en de synapsen worden handmatig geteld met Behulp van ImageJ, of een uitgebreidere kwantificering van synaptische structuren wordt uitgevoerd met beeldanalyseprocedures die op maat zijn geschreven in Matlab.
Introduction
Leeftijdsgebonden gehoorverlies is een van ‘s werelds meest voorkomende ziekten die meer dan een derde van de wereldbevolking van 65 jaar en oudertreft 1. De onderliggende oorzaken zijn nog steeds in discussie en worden actief onderzocht, maar kunnen het verlies van de gespecialiseerde synapsen omvatten die binnenste haarcellen (IHC’s) verbinden met afferente gehoorzenuwvezels2. Deze lintsynapsen bestaan uit een presynaptische structuur met blaasjes gevuld met de neurotransmitter glutamaat eraan vastgebonden, evenals postsynaptische α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionzuur (AMPA) glutamaatreceptoren 3,4,5. In de gerbil komen ~20 afferente gehoorzenuwvezels in contact met één IHC 6,7,8. Vezels op de IHC tegenover de modiolus zijn in tegenstelling tot grote synaptische linten, terwijl de vezels die aan de pijlerzijde van de IHC verbinden, kleine synaptische linten tegenkomen (d.w.z. bij katten9, gerbils7, cavia’s10 en muizen 3,11,12,13,14). Bovendien zijn in de gerbil de grootte van de presynaptische linten en de postsynaptische glutamaatpleisters positief gecorreleerd 7,14. Vezels die zich verzetten tegen grote linten aan de modiolaire kant van de IHC zijn klein van kaliber en hebben lage spontane snelheden en hoge drempels15. Er zijn aanwijzingen dat vezels met een lage spontane snelheid kwetsbaarder zijn voor blootstelling aan lawaai10 en ototoxische geneesmiddelen16 dan hoog-spontane laagdrempelige vezels, die zich aan de pijlerzijde van IHC’s15 bevinden.
Het verlies van lintsynapsen is de vroegste degeneratieve gebeurtenis in cochleair neuraal leeftijdsgebonden gehoorverlies, terwijl het verlies van spiraalvormige ganglioncellen en hun afferente gehoorzenuwvezels achterblijft bij17,18. Elektrofysiologische correlaten omvatten opnames van auditieve hersenstamresponsen17 en samengestelde actiepotentialen8; deze weerspiegelen echter niet de subtiliteiten van synapsverlies, omdat vezels met een lage spontane snelheid niet bijdragen aan deze metingen16. Meer veelbelovende elektrofysiologische metrieken zijn de massapotentiaal-afgeleide neurale index19 en de peristimulus-tijdrespons20. Deze zijn echter alleen betrouwbaar als het dier geen andere cochleaire pathologieën heeft, naast verlies van gehoorzenuwvezels, die de activiteit van de resterende gehoorzenuwvezels beïnvloeden8. Bovendien waren gedragsmatig beoordeelde drempels in de gerbil niet gecorreleerd met synapsgetallen21. Daarom is betrouwbare kwantificering van overlevende lintsynapsen en dus het aantal functionele gehoorzenuwvezels alleen mogelijk door direct onderzoek van het cochleaire weefsel.
De Mongoolse gerbil (Meriones unguiculatus) is een geschikt diermodel voor het bestuderen van leeftijdsgebonden gehoorverlies. Het heeft een korte levensduur, heeft een laagfrequent gehoor vergelijkbaar met mensen, is gemakkelijk te onderhouden en vertoont overeenkomsten met menselijke pathologieën gerelateerd aan leeftijdsgebonden gehoorverlies 2,22,23,24. Gerbils worden als oud beschouwd wanneer ze 36 maanden oud zijn, wat bijna het einde van hun gemiddelde levensduur22 is. Belangrijk is dat een leeftijdsgebonden verlies van lintsynapsen is aangetoond bij gerbils die zijn opgevoed en verouderd in rustige omgevingen 8,21.
Hier wordt een protocol gepresenteerd om slakkenhuis van gerbils van verschillende leeftijden, van jongvolwassenen tot oud, te labelen, te ontleden en te analyseren. Antilichamen gericht tegen componenten van de presynapse (CtBP2), postsynaptische glutamaatreceptorpleisters (GluA2) en IHC’s (myoVIIa) worden gebruikt. Er wordt een autofluorescentie quencher toegepast die de achtergrond in verouderd slakkenhuis vermindert en het fluorescentiesignaal intact laat. Verder wordt een beschrijving gegeven van hoe het slakkenhuis te ontleden om zowel het sensorische epitheel als de stria vascularis te onderzoeken. De cochleaire lengte wordt gemeten om de selectie van verschillende cochleaire locaties mogelijk te maken die overeenkomen met specifieke beste frequenties25. Kwantificering van synapsnummers wordt uitgevoerd met de vrij beschikbare software ImageJ26. Aanvullende kwantificering van synapsvolumes en locaties binnen de individuele HC wordt uitgevoerd met software die op maat is geschreven in Matlab. Deze software wordt niet openbaar gemaakt, omdat de auteurs niet over de middelen beschikken om professionele documentatie en ondersteuning te bieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de methode die in dit protocol wordt beschreven, is het mogelijk om IHC’s en synaptische structuren in slakkenhuizen van jongvolwassen en oudere gerbils te immunolabelen, veronderstelde functionele synapsen te identificeren door colokalisatie van pre- en postsynaptische elementen, ze toe te wijzen aan individuele IHC’s en hun aantal, volume en locatie te kwantificeren. De antilichamen die in deze aanpak werden gebruikt, labelden ook buitenste haarcellen (OHCs; myoVIIa) en hun presynaptische linten. Bovendien is een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Lichun Zhang voor het helpen opzetten van de methode en de Fluorescence Microscopy Service Unit, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, voor het gebruik van de beeldvormingsfaciliteiten. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse Excellence Strategy -EXC 2177/1.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
