若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数

加齢性難聴は、65歳以上の世界人口の3分の1以上が罹患する世界で最も普及している疾患の1つです¹。根本的な原因はまだ議論中であり、積極的に調査中ですが、内部有毛細胞(IHC)と求心性聴覚神経線維²をつなぐ特殊なシナプスの喪失が含まれる可能性があります。これらのリボンシナプスは、神経伝達物質グルタミン酸で満たされた小胞がそれにつながれたシナプス前構造、ならびにシナプス後α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)グルタミン酸受容体^3,4,5を含む。スナネズミでは、〜20個の求心性聴覚神経線維が1つのIHC^6、7、8に接触する。モディオラスに面したIHC上の線維は大きなシナプスリボンに対向し、IHCの柱側で接続する線維は小さなシナプスリボンに対向している(すなわち、ネコ⁹、スナネズミ⁷、モルモット10、およびマウス³、11、^12、13、14)。さらに、スナネズミでは、シナプス前リボンおよびシナプス後グルタミン酸パッチのサイズは正の相関がある^7,14。IHCのモディオラー側の大きなリボンに対向する繊維は口径が小さく、自発速度が低く、閾値が高い¹⁵。低自発速度繊維は、IHCs15の柱側に位置する高自発的低閾値繊維よりも、騒音曝露¹⁰および耳毒性薬物¹⁶に対してより脆弱であるという証拠がある。

リボンシナプスの喪失は、蝸牛神経加齢性難聴における最も初期の変性事象であるが、螺旋状神経節細胞およびその求心性聴覚神経線維の喪失は^17,18に遅れをとっている。電気生理学的相関は、聴覚脳幹応答¹⁷および化合物活動電位⁸の記録を含み;しかし、これらはシナプス損失の微妙さを反映していない、なぜなら低い自発速度繊維はこれらの尺度に寄与しない^{からである16}。より有望な電気生理学的測定基準は、質量電位誘導神経指数¹⁹および刺激周囲時間応答²⁰である。しかしながら、これらは、動物が聴覚神経線維喪失を超えて、残りの聴覚神経線維⁸の活動に影響を及ぼす他の蝸牛病理を有していない場合にのみ信頼できる。さらに、スナネズミにおける行動学的に評価された閾値は、シナプス数²¹と相関していなかった。したがって、生存しているリボンシナプスの信頼できる定量化、したがって、機能的な聴覚神経線維の数は、蝸牛組織の直接検査によってのみ可能である。

モンゴルのスナネズミ(Meriones unguiculatus)は、加齢性難聴を研究するのに適した動物モデルです。それは短い寿命を有し、ヒトに似た低周波聴力を有し、維持が容易であり、加齢性難聴に関連するヒト病理との類似性を示す^2,22,23,24。スナネズミは、生後36ヶ月に達すると老化したとみなされ、平均寿命の終わり近くになります²²。重要なことに、リボンシナプスの加齢に伴う喪失は、静かな環境で飼育され老化したスナネズミで実証されている^8,21。

ここでは、若年成人から加齢までの異なる年齢のスナネズミからの蝸牛を免疫標識、解剖、および分析するためのプロトコールが提示される。シナプス前部(CtBP2)、シナプス後グルタミン酸受容体パッチ(GluA2)、およびIHC(myoVIIa)の成分に対する抗体が使用される。老化した蝸牛のバックグラウンドを減少させ、蛍光シグナルをそのまま残す自己蛍光消光剤が適用されます。また、感覚上皮と線条体血管の両方を調べるために蝸牛を解剖する方法について説明する。蝸牛の長さは、特定の最良の周波数²⁵に対応する別個の蝸牛位置の選択を可能にするために測定される。シナプス数の定量化は、自由に入手可能なソフトウェアImageJ²⁶を用いて行われる。個々のHC内のシナプスボリュームと位置の追加定量化は、Matlabで書かれたソフトウェアカスタムで実行されます。このソフトウェアは、著者が専門的なドキュメントとサポートを提供するためのリソースが不足しているため、一般に公開されていません。