Sinapsis de cinta de inmunoetiquetado y conteo en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos
Summary
Se presenta un protocolo para el procesamiento de cócleas de jerbos adultos jóvenes y ancianos mediante el inmunoetiquetado de las estructuras sinápticas aferentes y las células ciliadas, el apagado de la autofluorescencia en el tejido envejecido, la disección y estimación de la longitud de las cócleas y la cuantificación de las sinapsis en pilas de imágenes obtenidas con imágenes confocales.
Abstract
Se supone que la pérdida de sinapsis de cinta que conectan las células ciliadas internas y las fibras nerviosas auditivas aferentes es una de las causas de la pérdida auditiva relacionada con la edad. El método más común para detectar la pérdida de sinapsis de cinta es el inmunoetiquetado porque permite el muestreo cuantitativo de varias ubicaciones tonotópicas en una cóclea individual. Sin embargo, las estructuras de interés están enterradas profundamente dentro de la cóclea ósea. Los jerbos se utilizan como modelo animal para la pérdida de audición relacionada con la edad. Aquí, se describen los protocolos de rutina para la fijación, el inmunoetiquetado de montajes enteros cocleares de jerbos, las imágenes confocales y la cuantificación de los números y volúmenes de sinapsis de cinta. Además, se destacan los desafíos particulares asociados con la obtención de buen material de personas valiosas que envejecen.
Los jerbos son sacrificados y perfundidos cardiovascularmente, o sus bullas timpánicas se diseccionan cuidadosamente fuera del cráneo. Las cócleas se abren en el ápice y la base y se transfieren directamente al fijador. Independientemente del método inicial, las cócleas se fijan posteriormente y posteriormente se descalcifican. Luego, el tejido se etiqueta con anticuerpos primarios contra estructuras pre y postsinápticas y células ciliadas. A continuación, las cócleas se incuban con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que son específicos contra sus respectivos primarios. Las cócleas de los jerbos envejecidos se tratan con un silenciador de autofluorescencia para reducir la fluorescencia de fondo típicamente sustancial de los tejidos de los animales más viejos.
Finalmente, las cócleas se diseccionan en 6-11 segmentos. Toda la longitud coclear se reconstruye de tal manera que las ubicaciones cocleares específicas se pueden determinar de manera confiable entre individuos. Las pilas de imágenes confocales, adquiridas secuencialmente, ayudan a visualizar las células ciliadas y las sinapsis en las ubicaciones elegidas. Las pilas confocales se descontorbanican, y las sinapsis se cuentan manualmente utilizando ImageJ, o se lleva a cabo una cuantificación más extensa de las estructuras sinápticas con procedimientos de análisis de imágenes escritos a medida en Matlab.
Introduction
La pérdida de audición relacionada con la edad es una de las enfermedades más prevalentes del mundo que afecta a más de un tercio de la población mundial de 65 años o más1. Las causas subyacentes aún están en debate y se están investigando activamente, pero pueden incluir la pérdida de las sinapsis especializadas que conectan las células ciliadas internas (IHC) con las fibras nerviosas auditivas aferentes2. Estas sinapsis de cinta comprenden una estructura presináptica que tiene vesículas llenas del neurotransmisor glutamato atado a ella, así como receptores postsinápticos de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA) glutamato 3,4,5. En el jerbo, ~ 20 fibras nerviosas auditivas aferentes entran en contacto con un IHC 6,7,8. Las fibras en el IHC frente al modiolus se oponen a las cintas sinápticas grandes, mientras que las fibras que se conectan en el lado del pilar del IHC se enfrentan a pequeñas cintas sinápticas (es decir, en gatos9, jerbos7, conejillos de indias10 y ratones 3,11,12,13,14). Además, en el jerbo, el tamaño de las cintas presinápticas y los parches de glutamato postsináptico se correlacionan positivamente 7,14. Las fibras que se oponen a las cintas grandes en el lado modiolar de la IHC son de calibre pequeño y tienen bajas tasas espontáneas y umbrales altos15. Existe evidencia de que las fibras de baja tasa espontánea son más vulnerables a la exposición al ruido10 y a los fármacos ototóxicos16 que las fibras de bajo umbral altamente espontáneas, que se encuentran en el lado del pilar de los IHC15.
La pérdida de sinapsis de cinta es el evento degenerativo más temprano en la pérdida auditiva relacionada con la edad neuronal coclear, mientras que la pérdida de células ganglionares espirales y sus fibras nerviosas auditivas aferentes se queda atrásde 17,18. Los correlatos electrofisiológicos incluyen registros de respuestas auditivas del tronco encefálico17 y potenciales de acción compuesto8; sin embargo, estos no reflejan las sutilezas de la pérdida de sinapsis, ya que las fibras de baja tasa espontánea no contribuyen a estas medidas16. Las métricas electrofisiológicas más prometedoras son el índice neuronal derivado del potencial de masa19 y la respuesta de tiempo periestímulo20. Sin embargo, estos solo son confiables si el animal no tiene otras patologías cocleares, más allá de la pérdida de fibras nerviosas auditivas, que afecten la actividad de las fibras nerviosas auditivas restantes8. Además, los umbrales evaluados conductualmente en el jerbo no se correlacionaron con los números de sinapsis21. Por lo tanto, la cuantificación confiable de las sinapsis de cinta sobrevivientes y, por lo tanto, el número de fibras nerviosas auditivas funcionales solo es posible mediante el examen directo del tejido coclear.
El jerbo mongol (Meriones unguiculatus) es un modelo animal adecuado para estudiar la pérdida auditiva relacionada con la edad. Tiene una vida útil corta, tiene audición de baja frecuencia similar a la humana, es fácil de mantener y muestra similitudes con patologías humanas relacionadas con la pérdida auditiva relacionada con la edad 2,22,23,24. Los jerbos se consideran envejecidos cuando alcanzan los 36 meses de edad, que está cerca del final de su vida útil promedio22. Es importante destacar que se ha demostrado una pérdida de sinapsis de cinta relacionada con la edad en jerbos criados y envejecidos en ambientes tranquilos 8,21.
Aquí, se presenta un protocolo para inmunoetiquetar, diseccionar y analizar cócleas de jerbos de diferentes edades, desde adultos jóvenes hasta ancianos. Se utilizan anticuerpos dirigidos contra componentes del presinaptaso (CtBP2), parches de receptores de glutamato postsinápticos (GluA2) y IHC (myoVIIa). Se aplica un silenciador de autofluorescencia que reduce el fondo en las cócleas envejecidas y deja intacta la señal de fluorescencia. Además, se da una descripción de cómo diseccionar la cóclea para examinar tanto el epitelio sensorial como la estría vascular. La longitud coclear se mide para permitir la selección de distintas ubicaciones cocleares que corresponden a las mejores frecuencias específicas25. La cuantificación de los números de sinapsis se lleva a cabo con el software gratuito ImageJ26. La cuantificación adicional de los volúmenes y ubicaciones de sinapsis dentro del HC individual se realiza con un software personalizado escrito en Matlab. Este software no se pone a disposición del público, ya que los autores carecen de los recursos para proporcionar documentación y soporte profesional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el método descrito en este protocolo, es posible inmunoetiquetar IHC y estructuras sinápticas en cócleas de jerbos adultos jóvenes y envejecidos, identificar presuntas sinapsis funcionales mediante la colocalización de elementos pre y postsinápticos, asignarlos a IHC individuales y cuantificar su número, volumen y ubicación. Los anticuerpos utilizados en este enfoque también etiquetaron las células ciliadas externas (OHC; myoVIIa) y sus cintas presinápticas. Además, una alternativa viable para el inmunoe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen a Lichun Zhang por ayudar a establecer el método y a la Unidad de Servicio de Microscopía de Fluorescencia, Universidad Carl von Ossietzky de Oldenburg, para el uso de las instalaciones de imágenes. Esta investigación fue financiada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania -EXC 2177/1.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
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