סינפסות סרט אימונו-לבלים וספירתם בשבלול גרביל הצעיר והזקן
Summary
מוצג פרוטוקול לעיבוד שבלול גרביל צעיר ומזדקן על ידי סימון חיסוני של המבנים הסינפטיים ותאי השערה האפרנטיים, מרווה אוטופלואורסצנטיות ברקמה מזדקנת, ניתוח והערכת אורך השבלול, וכימות הסינפסות בערימות תמונה המתקבלות בהדמיה קונפוקלית.
Abstract
ההנחה היא שאובדן הסינפסות של הסרט המחברות בין תאי שערה פנימיים לסיבי עצב שמיעתיים עזים הוא אחד הגורמים לאובדן שמיעה הקשור לגיל. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי אובדן של סינפסות סרט היא סימון חיסוני מכיוון שהיא מאפשרת דגימה כמותית מכמה מקומות טונוטופיים בשבב בודד. עם זאת, המבנים המעניינים קבורים עמוק בתוך השבלול הגרמי. גרבילים משמשים כמודל לבעלי חיים לליקוי שמיעה הקשור לגיל. כאן מתוארים פרוטוקולים שגרתיים לקיבוע, אימונו-לבלים של שבלול גרביל, הדמיה קונפוקלית וכימות מספרים ונפחים של סינפסות של סרט. יתר על כן, האתגרים המסוימים הקשורים להשגת חומר טוב מאנשים מזדקנים בעלי ערך מודגשים.
גרבילים מורדמים מורדמים ומופרעים קרדיווסקולרית, או שהבולות הטימפניות שלהם מנותחות בקפידה מתוך הגולגולת. השבלול נפתחים בקצה ובבסיס ומועברים ישירות לקיבוע. ללא קשר לשיטה הראשונית, השבלולים הם postfixed ולאחר מכן decalcified. לאחר מכן, הרקמה מסומנת בנוגדנים ראשוניים נגד מבנים ותאי שיער טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. לאחר מכן, השבלולים מודגרים עם נוגדנים משניים המתויגים פלואורסצנטית שהם ספציפיים כנגד אלה העיקריים שלהם. השבלול של גרבילים מזדקנים מטופלים לאחר מכן באמצעות קוונצ’ר אוטופלואורסצנטי כדי להפחית את הפלואורסצנציה המשמעותית בדרך כלל ברקע של רקמות של בעלי חיים מבוגרים.
לבסוף, שבלול מנותחים לתוך 6-11 קטעים. כל אורך השבלול משוחזר כך שניתן לקבוע באופן מהימן מיקומים ספציפיים של שבלול בין פרטים. ערימות תמונות קונפוקליות, שנרכשו ברצף, מסייעות לדמיין תאי שיער וסינפסות במיקומים שנבחרו. ערימות הקונפוקלים מתפרקות, והסינפסות נספרות באופן ידני באמצעות ImageJ, או שכימות נרחב יותר של מבנים סינפטיים מתבצע עם הליכי ניתוח תמונה שנכתבו בהתאמה אישית ב- Matlab.
Introduction
ליקוי שמיעה הקשור לגיל הוא אחת המחלות הנפוצות ביותר בעולם המשפיעה על יותר משליש מאוכלוסיית העולם בגילאי 65 ומעלה1. הסיבות הבסיסיות עדיין נמצאות בוויכוח ונחקרות באופן פעיל, אך עשויות לכלול את אובדן הסינפסות המיוחדות המחברות תאי שערה פנימיים (IHCs) עם סיבי עצב שמיעתיים2. סינפסות סרט אלה מורכבות ממבנה קדם-סינפטי שיש בו שלפוחיות מלאות במוליך העצבי גלוטמט הקשור אליו, כמו גם קולטני גלוטמט α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית (AMPA) קולטני גלוטמט 3,4,5. בגרביל, כ-20 סיבי עצב שמיעתיים אפרנטיים יוצרים קשר עם IHC אחד 6,7,8. הסיבים ב-IHC הפונים אל המודיולוס מנוגדים לסרטים סינפטיים גדולים, בעוד שהסיבים המתחברים בצד העמוד של ה-IHC מפנים סרטים סינפטיים קטנים (כלומר, בחתולים9, גרבילים7, שרקנים10 ועכברים 3,11,12,13,14). יתר על כן, בגרביל, גודלם של הסרטים הקדם-סינפטיים וכתמי הגלוטמט הפוסט-סינפטיים מתואמים באופן חיובי 7,14. סיבים המתנגדים לסרטים גדולים בצד המודילרי של ה-IHC הם קטנים בקליבר ובעלי קצבים ספונטניים נמוכים וסף גבוה15. ישנן עדויות לכך שסיבים בעלי קצב ספונטני נמוך פגיעים יותר לחשיפה לרעש10 ולתרופות אוטוטוקסיות16 מאשר לסיבים בעלי סף נמוך ספונטני גבוה, הממוקמים בצד העמוד של מעגלים משולבים15.
אובדן הסינפסות של הסרט הוא האירוע הניווני המוקדם ביותר בליקוי שמיעה הקשור לגיל העצבי של השבלול, בעוד שאובדן תאי הגנגליון הספירליים וסיבי עצב השמיעה שלהם מפגרים אחרי17,18. קורלציות אלקטרופיזיולוגיות כוללות הקלטות של תגובות גזע המוח השמיעתי17 ופוטנציאלי פעולה מורכבים8; עם זאת, אלה אינם משקפים את הדקויות של אובדן סינפסה, שכן סיבי קצב ספונטני נמוך אינם תורמים לאמצעים אלה16. מדדים אלקטרופיזיולוגיים מבטיחים יותר הם האינדקס העצבי הנגזר מפוטנציאל המסה19 ותגובת הזמן של הפריסטימולוס20. עם זאת, אלה אמינים רק אם לבעל החיים אין פתולוגיות שבלול אחרות, מעבר לאובדן סיבי עצב שמיעתיים, המשפיעות על פעילותם של סיבי העצב השמיעתיים הנותרים8. יתר על כן, ערכי סף שהוערכו התנהגותית בגרביל לא היו מתואמים עם מספרי סינפסה21. לכן, כימות אמין של סינפסות הסרט ששרדו, ולכן, מספר סיבי העצב השמיעתיים התפקודיים אפשרי רק על ידי בדיקה ישירה של רקמת השבלול.
הגרביל המונגולי (Meriones unguiculatus) הוא מודל חייתי מתאים לחקר ליקוי שמיעה הקשור לגיל. יש לו תוחלת חיים קצרה, יש לו שמיעה בתדירות נמוכה הדומה לבני אדם, הוא קל לתחזוקה, ומראה קווי דמיון לפתולוגיות אנושיות הקשורות לליקוי שמיעה הקשור לגיל 2,22,23,24. גרבילים נחשבים לגיל מבוגר כאשר הם מגיעים לגיל 36 חודשים, שהוא לקראת סוף אורך החיים הממוצע שלהם22. חשוב לציין, אובדן תלוי גיל של סינפסות סרט הודגם בגרבילים שגדלו והתיישנו בסביבות שקטות 8,21.
כאן מוצג פרוטוקול לתבל, לנתח ולנתח שבלול מהגרבילים בגילאים שונים, ממבוגרים צעירים ועד זקנים. נוגדנים המכוונים נגד רכיבים של presynapse (CtBP2), מדבקות קולטן גלוטמט פוסט-סינפטי (GluA2) ו- IHCs (myoVIIa) משמשים. מופעל קוונצ’ר אוטופלואורסצנטי המפחית את הרקע בשבבייה מזדקנת ומשאיר את האות הפלואורסצנטי ללא פגע. יתר על כן, ניתן תיאור של כיצד לנתח את השבלול כדי לבחון הן את האפיתל החושי והן את stria vascularis. אורך השבלול נמדד כדי לאפשר בחירה של מיקומי שבלול מובחנים המתאימים לתדרים הטובים ביותר הספציפיים25. כימות של מספרי סינפסה מתבצע עם התוכנה הזמינה באופן חופשי ImageJ26. כימות נוסף של נפחי סינפסה ומיקומים בתוך HC הבודד מבוצע עם תוכנה מותאמת אישית שנכתבה ב- Matlab. תוכנה זו אינה זמינה לציבור, מכיוון שלמחברים חסרים המשאבים לספק תיעוד ותמיכה מקצועיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעזרת השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, ניתן לאימונולציה של IHCs ומבנים סינפטיים בשבלול מגרבילים צעירים ומבוגרים, לזהות סינפסות פונקציונליות משוערות על ידי לוקליזציה משותפת של אלמנטים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, להקצות אותם ל-IHCs בודדים ולכמת את מספרם, נפחם ומיקומם. הנוגדנים המשמשים בגישה זו ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לליצ’ון ז’אנג על שסייע בהקמת השיטה וליחידת השירות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אוניברסיטת קרל פון אוסייצקי באולדנבורג, על השימוש במתקני ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה – EXC 2177/1.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
