Immunoétiquetage et comptage des synapses rubanées chez les cochlées de gerbille jeunes adultes et âgées

La perte auditive liée à l’âge est l’une des maladies les plus répandues au monde qui touche plus d’un tiers de la population mondiale âgée de 65 ans et plus¹. Les causes sous-jacentes sont encore débattues et activement étudiées, mais peuvent inclure la perte des synapses spécialisées reliant les cellules ciliées internes (IHC) aux fibres nerveuses auditives afférentes². Ces synapses rubanées comprennent une structure présynaptique qui a des vésicules remplies du neurotransmetteur glutamate attaché à elle, ainsi que des récepteurs postsynaptiques α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique acide (AMPA) glutamate ^3,4,5. Dans la gerbille, ~ 20 fibres nerveuses auditives afférentes entrent en contact avec un IHC ^6,7,8. Les fibres de l’IHC faisant face au modiolus s’opposent aux grands rubans synaptiques, tandis que les fibres se connectant du côté pilier de l’IHC font face à de petits rubans synaptiques (c’est-à-dire chez les chats⁹, les gerbilles⁷, les cochons d’Inde¹⁰ et les souris 3,11,12,13,14). De plus, chez la gerbille, la taille des rubans présynaptiques et des patchs de glutamate postsynaptique est positivement corrélée ^7,14. Les fibres qui s’opposent aux grands rubans du côté modiolaire de l’IHC sont de petit calibre et ont de faibles taux spontanés et des seuils élevés¹⁵. Il existe des preuves que les fibres à faible taux spontané sont plus vulnérables à l’exposition au bruit¹⁰ et aux médicaments ototoxiques¹⁶ que les fibres à faible seuil spontanées élevées, qui sont situées du côté pilier des IHC¹⁵.

La perte de synapses rubanées est le premier événement dégénératif de la perte auditive liée à l’âge du neural cochléaire, tandis que la perte de cellules ganglionnaires en spirale et de leurs fibres nerveuses auditives afférentes est à la traîne par rapport à^17,18. Les corrélats électrophysiologiques comprennent les enregistrements des réponses auditives du tronc cérébral¹⁷ et des potentiels d’action^{composés 8}; cependant, ceux-ci ne reflètent pas les subtilités de la perte de synapses, car les fibres à faible taux spontané ne contribuent pas à ces mesures¹⁶. Les mesures électrophysiologiques les plus prometteuses sont l’indice neuronal dérivé du potentiel de masse¹⁹ et la réponse temporelle du péristimulus²⁰. Cependant, ceux-ci ne sont fiables que si l’animal n’a pas d’autres pathologies cochléaires, au-delà de la perte de fibres nerveuses auditives, qui affectent l’activité des fibres nerveuses auditives restantes⁸. De plus, les seuils évalués comportementalement chez la gerbille n’étaient pas corrélés avec les nombres de synapses²¹. Par conséquent, une quantification fiable des synapses ruban survivantes et, par conséquent, du nombre de fibres nerveuses auditives fonctionnelles n’est possible que par un examen direct du tissu cochléaire.

La gerbille mongole (Meriones unguiculatus) est un modèle animal approprié pour étudier la perte auditive liée à l’âge. Il a une courte durée de vie, a une audition à basse fréquence similaire à celle des humains, est facile à entretenir et présente des similitudes avec les pathologies humaines liées à la perte auditive liée à ^{l’âge 2,22,23,24}. Les gerbilles sont considérées comme âgées lorsqu’elles atteignent l’âge de 36 mois, soit vers la fin de leur durée de vie moyenne^{de 22 ans}. Il est important de noter qu’une perte de synapses rubans liée à l’âge a été démontrée chez des gerbilles élevées et vieillies dans des environnements calmes ^8,21.

Ici, un protocole pour immunomarquer, disséquer et analyser les cochlées de gerbilles d’âges différents, des jeunes adultes aux personnes âgées, est présenté. Des anticorps dirigés contre des composants de la presynapse (CtBP2), des patchs de récepteurs postsynaptiques du glutamate (GluA2) et des IHC (myoVIIa) sont utilisés. Un quencher d’autofluorescence est appliqué qui réduit le fond dans les cochlées vieillies et laisse le signal de fluorescence intact. En outre, une description est donnée de la façon de disséquer la cochlée pour examiner à la fois l’épithélium sensoriel et la stria vascularis. La longueur cochléaire est mesurée pour permettre la sélection d’emplacements cochléaires distincts qui correspondent aux meilleures fréquences spécifiques²⁵. La quantification des nombres synaptiques est réalisée avec le logiciel gratuit ImageJ²⁶. Une quantification supplémentaire des volumes et des emplacements des synapses au sein du HC individuel est effectuée à l’aide d’un logiciel personnalisé écrit en Matlab. Ce logiciel n’est pas mis à la disposition du public, car les auteurs n’ont pas les ressources nécessaires pour fournir une documentation et un support professionnels.