Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek
Summary
Doku kesitlerinin kalınlığı deri innervasyonunun morfolojik çalışmasını sınırladı. Mevcut protokol, konfokal mikroskopi altında kalın 300 μm doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için benzersiz bir doku temizleme tekniğini tanımlamaktadır.
Abstract
Deri innervasyonu periferik sinir sisteminin önemli bir parçasıdır. Kutanöz sinir liflerinin incelenmesi hızla ilerlemiş olsa da, dağılım ve kimyasal özelliklerinin anlaşılmasının çoğu, ince doku kesitlerinde geleneksel histokimyasal ve immünohistokimyasal boyamadan kaynaklanmaktadır. Doku temizleme tekniğinin gelişmesiyle birlikte daha kalın doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerinin görüntülenmesi mümkün hale gelmiştir. Mevcut protokol, iki tipik kıllı ve göz kamaştırıcı cilt bölgesi olan sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisinden 300 μm kalınlığında doku kesitlerinde çoklu floresan boyamasını tanımlamaktadır. Burada, kalsitonin geni ile ilişkili peptid duyusal sinir liflerini etiketlerken, faloidin ve lenfatik damar endotelyal hyaluronan reseptörü 1 sırasıyla kan ve lenfatik damarları etiketler. Konfokal mikroskop altında, etiketli duyusal sinir lifleri tamamen daha uzun bir mesafeden takip edildi, derin kutanöz tabakada demetler halinde ve yüzeysel tabakada serbest stilde çalıştı. Bu sinir lifleri kan damarlarına paralel olarak koştu veya onları çevreledi ve lenfatik damarlar tüylü ve göz kamaştırıcı ciltte üç boyutlu (3D) bir ağ oluşturdu. Mevcut protokol, cilt innervasyonunu incelemek için metodoloji perspektifinden mevcut geleneksel yöntemlerden daha etkili bir yaklaşım sunmaktadır.
Introduction
Vücudun en büyük organı olan ve çevreye anahtar bir arayüz görevi gören deri, birçok sinir lifi tarafından yoğun bir şekilde innerve edilir 1,2,3. Deri innervasyonu daha önce tüm deri ve doku kesitlerinde boyama gibi çeşitli histolojik yöntemlerle yaygın olarak çalışılmasına rağmen, 4,5,6, kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı etkili gösterimi hala bir zorluktur 7,8. Bu göz önüne alındığında, mevcut protokol, kalın doku bölümünde kutanöz sinir liflerini daha net sergilemek için benzersiz bir teknik geliştirmiştir.
Kesitlerin kalınlığına göre sınır nedeniyle, innerve deri sinir liflerinin gözlemlenmesi, elde edilen görüntü bilgisinden kalsitonin gen ile ilişkili peptid (CGRP) sinir lifleri ile lokal doku ve organlar arasındaki ilişkiyi doğru bir şekilde tasvir edecek kadar kesin değildir. 3D doku temizleme teknolojisinin ortaya çıkışı bu sorunu çözmek için uygulanabilir bir yöntem sağlar 9,10. Doku temizleme yaklaşımlarının hızla gelişmesi, son zamanlarda doku yapılarını, tüm organları, nöronal projeksiyonları ve bütün hayvanları incelemek için birçok araç sunmuştur11. Şeffaf cilt dokusu, kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için veri elde etmek için konfokal mikroskopi ile çok daha kalın bir bölümde görüntülenebilir.
Bu çalışmada, bir sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisi, tüylü ve göz kamaştırıcı cildin iki hedef bölgesi olarak seçilmiştir 3,4,7. Kutanöz sinir liflerini daha uzun bir mesafede izlemek için, cilt dokusu immünohistokimyasal ve histokimyasal boyama için 300 μm kalınlığında dilimlendi ve ardından doku temizleme tedavisi uygulandı. CGRP, duyusal sinir liflerini12,13 olarak etiketlemek için kullanıldı. Ek olarak, doku arka planındaki kutanöz sinir liflerini vurgulamak için, sırasıyla 14,15 kan damarlarını ve lenfatik damarları etiketlemek için falloidin ve lenfatik damar endotelyal hyalurondan reseptör 1 (LYVE1) daha fazla kullanılmıştır.
Bu yaklaşımlar, kutanöz sinir liflerinin yüksek çözünürlüklü bir görünümünü göstermek ve ayrıca derideki sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar arasındaki uzamsal korelasyonu görselleştirmek için uygulanabilecek basit bir yöntem sağladı; bu, normal cildin homeostazını ve patolojik koşullar altında kutanöz değişikliği anlamak için çok daha fazla bilgi sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, deri innervasyonunu daha iyi anlamak için daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan ve 3D görünüm ile daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan kullanılarak tüylü ve göz kamaştırıcı derideki kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı bir gösterimini sunmaktadır. 1-2 güne kadar antikor inkübasyon süresi ve gece boyunca temizleme işlemi önemlidir. Bu iki önemli adım, kalın kesitlerin immünofloresan boyama etkisini doğrudan etkiler. Hepsi kalın kesitler için uygun olmayan antikor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Tıp Bilimleri Akademisi İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. CI2021A03404) ve Ulusal Geleneksel Çin Tıbbı Disiplinlerarası İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
