Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze
Summary
Die Dicke der Gewebeschnitte schränkte die morphologische Untersuchung der Hautinnervation ein. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Gewebereinigungstechnik zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern in dicken 300 μm Gewebeschnitten unter konfokaler Mikroskopie.
Abstract
Hautinnervation ist ein wichtiger Teil des peripheren Nervensystems. Obwohl das Studium der kutanen Nervenfasern schnell vorangekommen ist, stammt der größte Teil des Verständnisses ihrer verteilungsbedingten und chemischen Eigenschaften aus der konventionellen histochemischen und immunhistochemischen Färbung auf dünnen Gewebeschnitten. Mit der Entwicklung der Gewebereinigungstechnik ist es möglich geworden, die Hautnervenfasern auf dickeren Gewebeschnitten zu betrachten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die mehrfache fluoreszierende Färbung auf Gewebeschnitten mit einer Dicke von 300 μm aus der Plantar- und Rückenhaut von Rattenhinterfuß, den beiden typischen behaarten und kahlen Hautstellen. Hier markiert das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid die sensorischen Nervenfasern, während Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 des Lymphgefäßes die Blut- bzw. Lymphgefäße markieren. Unter einem konfokalen Mikroskop wurden die markierten sensorischen Nervenfasern vollständig auf längere Distanz verfolgt, in Bündeln in der tiefen Hautschicht und Freestyle in der oberflächlichen Schicht. Diese Nervenfasern verliefen parallel zu den Blutgefäßen oder umgaben sie, und Lymphgefäße bildeten ein dreidimensionales (3D) Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Das aktuelle Protokoll bietet einen effektiveren Ansatz zur Untersuchung der Hautinnervation als die bestehenden konventionellen Methoden aus methodischer Sicht.
Introduction
Die Haut, das größte Organ im Körper, das als Schlüsselschnittstelle zur Umwelt dient, wird von vielen Nervenfasern dicht innerviert 1,2,3. Obwohl die Hautinnervation zuvor mit verschiedenen histologischen Methoden, wie der Färbung auf ganzer Haut und Gewebeabschnitten 4,5,6, umfassend untersucht wurde, ist der detaillierte effektive Nachweis von Hautnervenfasern immer noch eine Herausforderung 7,8. Vor diesem Hintergrund entwickelte das vorliegende Protokoll eine einzigartige Technik, um kutane Nervenfasern im dicken Gewebeabschnitt deutlicher darzustellen.
Aufgrund der Grenze durch die Dicke der Abschnitte ist die Beobachtung von innervierten Hautnervenfasern nicht präzise genug, um die Beziehung zwischen Calcitonin-Gen-related Peptide (CGRP) Nervenfasern und lokalen Geweben und Organen aus den aufgenommenen Bildinformationen genau darzustellen. Das Aufkommen der 3D-Gewebereinigungstechnologie bietet eine praktikable Methode, um dieses Problem zu lösen 9,10. Die schnelle Entwicklung von Gewebe-Clearing-Ansätzen hat in jüngster Zeit viele Werkzeuge zur Untersuchung von Gewebestrukturen, ganzen Organen, neuronalen Projektionen und ganzen Tieren angeboten11. Das transparente Hautgewebe könnte in einem viel dickeren Abschnitt durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, um die Daten zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern zu erhalten.
In der aktuellen Studie wurde die Plantar- und Rückenhaut eines Rattenhinterfußes als die beiden Zielstellen von behaarter und kahler Hautausgewählt 3,4,7. Um die Hautnervenfasern in größerer Entfernung zu verfolgen, wurde das Hautgewebe in einer Dicke von 300 μm für die immunhistochemische und histochemische Färbung geschnitten, gefolgt von einer Gewebereinigungsbehandlung. CGRP wurde verwendet, um die sensorischen Nervenfasern12,13 zu kennzeichnen. Um die kutanen Nervenfasern auf dem Gewebehintergrund hervorzuheben, wurden außerdem Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 (LYVE1) verwendet, um die Blutgefäße bzw. Lymphgefäße14,15 zu markieren.
Diese Ansätze lieferten eine einfache Methode, die angewendet werden kann, um eine hochauflösende Ansicht der kutanen Nervenfasern zu demonstrieren und auch die räumliche Korrelation zwischen den Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der Haut zu visualisieren, was viel mehr Informationen liefern kann, um die Homöostase der normalen Haut und die Hautveränderung unter den pathologischen Bedingungen zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorliegende Studie liefert eine detaillierte Demonstration der kutanen Nervenfasern in der behaarten und kahlen Haut durch die Verwendung von Immunfluoreszenz auf dickeren Gewebeabschnitten mit Clearing-Behandlung und einer 3D-Ansicht, um die Hautinnervation besser zu verstehen. Die Antikörper-Inkubationszeit von bis zu 1-2 Tagen und ein Reinigungsprozess über Nacht sind wichtig. Diese beiden Schlüsselschritte wirken sich direkt auf die Immunfluoreszenzfärbungswirkung von dicken Abschnitten aus. Ein weiteres Prob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Projektcode Nr. CI2021A03404) und der National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary Innovation Fund (Projektcode-Nr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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