Démonstration de l’innervation de la peau poilue et glabre dans un motif 3D à l’aide de multiples approches de coloration fluorescente et de nettoyage des tissus
Summary
L’épaisseur des coupes tissulaires limitait l’étude morphologique de l’innervation de la peau. Le présent protocole décrit une technique unique de nettoyage des tissus pour visualiser les fibres nerveuses cutanées dans des coupes de tissus épaisses de 300 μm sous microscopie confocale.
Abstract
L’innervation de la peau est une partie importante du système nerveux périphérique. Bien que l’étude des fibres nerveuses cutanées ait progressé rapidement, la plupart de la compréhension de leurs caractéristiques distributives et chimiques provient de la coloration histochimique et immunohistochimique conventionnelle sur des coupes de tissus minces. Avec le développement de la technique de nettoyage des tissus, il est devenu possible de voir les fibres nerveuses cutanées sur des sections de tissus plus épaisses. Le présent protocole décrit de multiples colorations fluorescentes sur des coupes de tissus d’une épaisseur de 300 μm à partir de la peau plantaire et dorsale de l’arrière-pied de rat, les deux sites typiques de la peau poilue et glabre. Ici, le peptide lié au gène de la calcitonine marque les fibres nerveuses sensorielles, tandis que la phalloïdine et le récepteur hyaluronane endothélial 1 des vaisseaux lymphatiques marquent respectivement les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Sous un microscope confocal, les fibres nerveuses sensorielles marquées ont été suivies complètement sur une plus longue distance, en faisceaux dans la couche cutanée profonde et en style libre dans la couche superficielle. Ces fibres nerveuses couraient parallèlement ou entouraient les vaisseaux sanguins, et les vaisseaux lymphatiques formaient un réseau tridimensionnel (3D) dans la peau poilue et glabre. Le protocole actuel fournit une approche plus efficace pour étudier l’innervation de la peau que les méthodes conventionnelles existantes du point de vue de la méthodologie.
Introduction
La peau, le plus grand organe du corps, servant d’interface clé avec l’environnement, est densément innervée par de nombreuses fibres nerveuses 1,2,3. Bien que l’innervation de la peau ait été largement étudiée précédemment avec diverses méthodes histologiques, telles que la coloration sur des coupes de peau et de tissus de monture entière 4,5,6, la démonstration efficace détaillée des fibres nerveuses cutanées reste un défi 7,8. Compte tenu de cela, le présent protocole a développé une technique unique pour exposer plus clairement les fibres nerveuses cutanées dans la section de tissu épais.
En raison de la limite par l’épaisseur des sections, l’observation des fibres nerveuses de la peau innervées n’est pas assez précise pour décrire avec précision la relation entre les fibres nerveuses peptidiques liées au gène de la calcitonine (CGRP) et les tissus et organes locaux à partir des informations d’image acquises. L’émergence de la technologie de nettoyage des tissus 3D fournit une méthode réalisable pour résoudre ce problème 9,10. Le développement rapide d’approches de nettoyage des tissus a offert de nombreux outils pour étudier les structures tissulaires, les organes entiers, les projections neuronales et les animaux entiers ces derniers temps11. Le tissu cutané transparent pourrait être imagé dans une section beaucoup plus épaisse par microscopie confocale pour obtenir les données permettant de visualiser les fibres nerveuses cutanées.
Dans la présente étude, la peau plantaire et dorsale d’un pied postérieur de rat a été sélectionnée comme les deux sites cibles de la peau poilue et glabre 3,4,7. Pour tracer les fibres nerveuses cutanées à une plus grande distance, le tissu cutané a été tranché à l’épaisseur de 300 μm pour la coloration immunohistochimique et histochimique, suivie d’un traitement de nettoyage des tissus. Le CGRP a été utilisé pour marquer les fibres nerveuses sensorielles12,13. En outre, pour mettre en évidence les fibres nerveuses cutanées sur le fond tissulaire, la phalloïdine et le récepteur hyaluronique endothélial 1 des vaisseaux lymphatiques (LYVE1) ont également été utilisés pour marquer les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques, respectivement14,15.
Ces approches ont fourni une méthode simple qui peut être appliquée pour démontrer une vue à haute résolution des fibres nerveuses cutanées et aussi pour visualiser la corrélation spatiale entre les fibres nerveuses, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques de la peau, ce qui peut fournir beaucoup plus d’informations pour comprendre l’homéostasie de la peau normale et l’altération cutanée dans les conditions pathologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La présente étude fournit une démonstration détaillée des fibres nerveuses cutanées dans la peau poilue et glabre en utilisant l’immunofluorescence sur des sections de tissus plus épaisses avec un traitement de nettoyage et une vue 3D pour mieux comprendre l’innervation de la peau. Le temps d’incubation des anticorps allant jusqu’à 1-2 jours et un processus de nettoyage de nuit sont importants. Ces deux étapes clés affectent directement l’effet de coloration par immunofluorescence des sections épaiss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Fonds d’innovation de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (Code de projet no. CI2021A03404) et le Fonds national d’innovation interdisciplinaire en médecine traditionnelle chinoise (Code de projet no. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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