Demonstrando a inervação da pele cabeluda e glabrous em um padrão 3D usando múltiplas abordagens de coloração fluorescente e limpeza de tecidos
Summary
A espessura das seções teciduais limitou o estudo morfológico da inervação da pele. O presente protocolo descreve uma técnica única de limpeza tecidual para visualizar fibras nervosas cutâneas em seções de tecido espessas de 300 μm sob microscopia confocal.
Abstract
A inervação da pele é uma parte importante do sistema nervoso periférico. Embora o estudo das fibras nervosas cutâneas tenha progredido rapidamente, a maior parte da compreensão de suas características distribucionais e químicas vem da coloração histoquímica e imunohistoquímica convencional em seções de tecidos finos. Com o desenvolvimento da técnica de limpeza tecidual, tornou-se possível ver as fibras nervosas cutâneas em seções de tecido mais grossas. O presente protocolo descreve múltiplas manchas fluorescentes em seções de tecido a uma espessura de 300 μm da pele plantar e dorsal do pé traseiro de rato, os dois típicos locais de pele peludo e glabrous. Aqui, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina rotula as fibras nervosas sensoriais, enquanto a falo e o receptor endotelial do vaso endotelial 1 rotulam o sangue e os vasos linfáticos, respectivamente. Sob um microscópio confocal, as fibras nervosas sensoriais rotuladas foram seguidas completamente a uma distância mais longa, correndo em feixes na camada cutânea profunda e estilo livre na camada superficial. Essas fibras nervosas corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos, e os vasos linfáticos formavam uma rede tridimensional (3D) na pele pelirpelenta e glabrous. O protocolo atual fornece uma abordagem mais eficaz para estudar a inervação da pele do que os métodos convencionais existentes do ponto de vista da metodologia.
Introduction
A pele, o maior órgão do corpo, servindo como uma interface chave para o ambiente, é densamente inervada por muitas fibras nervosas 1,2,3. Embora a inervação da pele tenha sido amplamente estudada anteriormente com vários métodos histológicos, como a coloração em seções de pele e tecido demontagem total 4,5,6, a demonstração detalhada e eficaz de fibras nervosas cutâneas ainda é um desafio 7,8. Diante disso, o presente protocolo desenvolveu uma técnica única para exibir fibras nervosas cutâneas mais claramente na seção de tecido grosso.
Devido ao limite pela espessura das seções, a observação de fibras nervosas da pele inervadas não é precisa o suficiente para descrever com precisão a relação entre as fibras nervosas relacionadas ao gene da calcitonina (CGRP) e tecidos e órgãos locais a partir das informações de imagem adquiridas. O surgimento da tecnologia de limpeza de tecidos 3D fornece um método viável para resolver esse problema 9,10. O rápido desenvolvimento de abordagens de limpeza de tecidos tem oferecido muitas ferramentas para estudar estruturas teciduais, órgãos inteiros, projeções neuronais e animais inteiros nos últimostempos 11. O tecido da pele transparente pode ser imageado em uma seção muito mais espessa por microscopia confocal para obter os dados para visualizar fibras nervosas cutâneas.
No presente estudo, a pele plantar e dorsal de um pé traseiro de rato foi selecionada como os dois locais alvo de pelepelrosa e glabrous 3,4,7. Para traçar as fibras nervosas cutâneas a uma distância maior, o tecido da pele foi cortado na espessura de 300 μm para coloração imunohistoquímica e histoquímica, seguido de tratamento de limpeza tecidual. O CGRP foi usado para rotular as fibras sensoriais do nervo12,13. Além disso, para destacar as fibras nervosas cutâneas no fundo tecidual, a faloidina e o receptor de hialuronan do vaso linfático 1 (LYVE1) foram ainda utilizados para rotular os vasos sanguíneos e os vasos linfáticos, respectivamente14,15.
Essas abordagens forneceram um método simples que pode ser aplicado para demonstrar uma visão de alta resolução das fibras nervosas cutâneas e também para visualizar a correlação espacial entre as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele, o que pode fornecer muito mais informações para entender a homeostase da pele normal e a alteração cutânea sob as condições patológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente estudo fornece uma demonstração detalhada das fibras nervosas cutâneas na pele pelrosa e glabrous usando imunofluorescência em seções de tecido mais grosso com tratamento de limpeza e uma visão 3D para entender melhor a inervação da pele. O tempo de incubação de anticorpos de até 1-2 dias e um processo de limpeza noturno são importantes. Estas duas etapas-chave afetam diretamente o efeito de coloração da imunofluorescência de seções grossas. Outro problema foi levantado a partir da escolha de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Project Code no. CI2021A03404) e o Fundo Nacional de Inovação Interdisciplinar da Medicina Tradicional Chinesa (Project Code no. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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