Summary

Dimostrazione dell'innervazione della pelle pelosa e glabra in un modello 3D utilizzando più approcci fluorescenti di colorazione e pulizia dei tessuti

Published: May 20, 2022
doi:

Summary

Lo spessore delle sezioni tissutali limitava lo studio morfologico dell’innervazione cutanea. Il presente protocollo descrive una tecnica unica di pulizia dei tessuti per visualizzare le fibre nervose cutanee in sezioni di tessuto spesse 300 μm sotto microscopia confocale.

Abstract

L’innervazione della pelle è una parte importante del sistema nervoso periferico. Sebbene lo studio delle fibre nervose cutanee sia progredito rapidamente, la maggior parte della comprensione delle loro caratteristiche distributive e chimiche proviene dalla colorazione istochimica e immunoistochimica convenzionale su sezioni di tessuto sottile. Con lo sviluppo della tecnica di pulizia dei tessuti, è diventato possibile visualizzare le fibre nervose cutanee su sezioni di tessuto più spesse. Il presente protocollo descrive la colorazione fluorescente multipla su sezioni tissutali ad uno spessore di 300 μm dalla pelle plantare e dorsale del ratto posteriore, i due tipici siti cutanei pelosi e glabri. Qui, il peptide correlato al gene della calcitonina etichetta le fibre nervose sensoriali, mentre la falloidina e il recettore ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 etichettano rispettivamente i vasi sanguigni e linfatici. Sotto un microscopio confocale, le fibre nervose sensoriali etichettate sono state seguite completamente a una distanza più lunga, correndo in fasci nello strato cutaneo profondo e freestyle nello strato superficiale. Queste fibre nervose correvano in parallelo o circondavano i vasi sanguigni e i vasi linfatici formavano una rete tridimensionale (3D) nella pelle pelosa e glabra. L’attuale protocollo fornisce un approccio più efficace allo studio dell’innervazione cutanea rispetto ai metodi convenzionali esistenti dal punto di vista metodologico.

Introduction

La pelle, l’organo più grande del corpo, che funge da interfaccia chiave per l’ambiente, è densamente innervata da molte fibre nervose 1,2,3. Sebbene l’innervazione cutanea sia stata ampiamente studiata in precedenza con vari metodi istologici, come la colorazione su sezioni di pelle e tessuto intero 4,5,6, la dimostrazione efficace dettagliata delle fibre nervose cutanee è ancora una sfida 7,8. Detto questo, il presente protocollo ha sviluppato una tecnica unica per esporre le fibre nervose cutanee più chiaramente nella sezione del tessuto spesso.

A causa del limite per lo spessore delle sezioni, l’osservazione delle fibre nervose della pelle innervata non è abbastanza precisa da rappresentare con precisione la relazione tra le fibre nervose del peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) e i tessuti e gli organi locali dalle informazioni acquisite sull’immagine. L’emergere della tecnologia di compensazione dei tessuti 3D fornisce un metodo fattibile per risolvere questo problema 9,10. Il rapido sviluppo di approcci di compensazione dei tessuti ha offerto molti strumenti per studiare le strutture tissutali, interi organi, proiezioni neuronali e interi animali negli ultimi tempi11. Il tessuto cutaneo trasparente potrebbe essere ripreso in una sezione molto più spessa al microscopio confocale per ottenere i dati per visualizzare le fibre nervose cutanee.

Nel presente studio, la pelle plantare e dorsale di un ratto posteriore è stata selezionata come i due siti bersaglio della pelle pelosa e glabra 3,4,7. Per tracciare le fibre nervose cutanee a una distanza maggiore, il tessuto cutaneo è stato tagliato allo spessore di 300 μm per la colorazione immunoistochimica e istochimica, seguita da un trattamento di pulizia dei tessuti. CGRP è stato utilizzato per etichettare le fibre nervose sensoriali12,13. Inoltre, per evidenziare le fibre nervose cutanee sullo sfondo del tessuto, la falloidina e il recettore ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 (LYVE1) sono stati ulteriormente utilizzati per etichettare i vasi sanguigni e i vasi linfatici, rispettivamente14,15.

Questi approcci hanno fornito un metodo semplice che può essere applicato per dimostrare una visione ad alta risoluzione delle fibre nervose cutanee e anche per visualizzare la correlazione spaziale tra le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici della pelle, che può fornire molte più informazioni per comprendere l’omeostasi della pelle normale e l’alterazione cutanea nelle condizioni patologiche.

Protocol

Il presente studio è stato approvato dal Comitato Etico dell’Istituto di Agopuntura e Moxibustione, China Academy of Chinese Medical Sciences (numero di riferimento D2018-04-13-1). Tutte le procedure sono state condotte seguendo la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati tre ratti maschi adulti (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Tutti gli animali sono stati ospitati in un ciclo luce/buio di 12…

Representative Results

Dopo una tripla colorazione fluorescente, le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici sono stati chiaramente etichettati con CGRP, falloidina e LYVE1, rispettivamente, nella pelle pelosa e glabra (Figura 3,4). Con il trattamento di compensazione, le fibre nervose CGRP-positive, i vasi sanguigni phalloidin-positivi e i vasi linfatici LYVE1-positivi possono essere ripresi a una profondità maggiore per acquisire le informazioni strutturali complete della pelle (<stro…

Discussion

Il presente studio fornisce una dimostrazione dettagliata delle fibre nervose cutanee nella pelle pelosa e glabra utilizzando l’immunofluorescenza su sezioni di tessuto più spesse con trattamento di compensazione e una vista 3D per comprendere meglio l’innervazione della pelle. Il tempo di incubazione degli anticorpi fino a 1-2 giorni e un processo di pulizia notturno sono importanti. Questi due passaggi chiave influenzano direttamente l’effetto di colorazione dell’immunofluorescenza delle sezioni spesse. Un ulteriore p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dal China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Codice di progetto n. CI2021A03404) e il Fondo Nazionale per l’Innovazione Interdisciplinare di Medicina Tradizionale Cinese (Codice di Progetto n. ZYYCXTD-D-202202).

Materials

1x phosphate-buffered saline Solarbio Life Sciences P1020 pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol Sigma Life Science T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy Olympus Corporation Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 Abcam plc. ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 Abcam plc. ab175676
EP tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001 1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system Leica Biosystems CM1860
Imaris Software Oxford Instruments v.9.0.1
IRIS standard scissor WPI (World Precision Instruments Inc.) 503242
iSpacer SunJin Lab co. IS005
Micro forceps-Str RWD F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody Santa cruz biotechnology, Inc. sc-57053
Neutral buffered Formalin Solarbio Life Sciences G2161 10%
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch Laboratories 017-000-12 10 mL
Peristaltic pump Longer Precision Pump Co., Ltd BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A12381
RapiClear 1.52 solution SunJin Lab co. RC152001 10 mL
Regular agarose Gene Company Limited G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str RWD F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody R&D Systems, Inc. AF7939
Six-well plate Corning Incorporated 3335
Sodium azide Sigma Life Science S2002 25 g
Sucrose Sigma Life Science V900116 500 g
Super Glue Henkel AG & Co. Pattex 502
Surgical Handles RWD S32003-12
Triton X-100 Solarbio Life Sciences 9002-93-1 100 mL
Urethane Sigma Life Science U2500 500 g
VANNAS spring scissors RWD S1014-12
Vibratory microtome Leica Biosystems VT1200S

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Wang, X., Cao, W., Shi, J., Zhang, X., Qu, Z., Xu, D., Wan, H., Su, Y., He, W., Jing, X., Bai, W. Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches. J. Vis. Exp. (183), e63807, doi:10.3791/63807 (2022).

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