Demostración de la inervación de la piel peluda y glabra en un patrón 3D utilizando múltiples enfoques de tinción fluorescente y limpieza de tejidos
Summary
El grosor de las secciones de tejido limitó el estudio morfológico de la inervación de la piel. El presente protocolo describe una técnica única de limpieza de tejidos para visualizar las fibras nerviosas cutáneas en secciones de tejido gruesas de 300 μm bajo microscopía confocal.
Abstract
La inervación de la piel es una parte importante del sistema nervioso periférico. Aunque el estudio de las fibras nerviosas cutáneas ha progresado rápidamente, la mayor parte de la comprensión de sus características distributivas y químicas proviene de la tinción histoquímica e inmunohistoquímica convencional en secciones delgadas de tejido. Con el desarrollo de la técnica de limpieza de tejidos, ha sido posible ver las fibras nerviosas cutáneas en secciones de tejido más gruesas. El presente protocolo describe múltiples tinciones fluorescentes en secciones de tejido a un grosor de 300 μm de la piel plantar y dorsal de la pata trasera de rata, los dos sitios típicos de piel peluda y glabra. Aquí, el péptido relacionado con el gen de la calcitonina etiqueta las fibras nerviosas sensoriales, mientras que la faloidina y el receptor 1 de hialuronano endotelial de los vasos linfáticos etiquetan los vasos sanguíneos y linfáticos, respectivamente. Bajo un microscopio confocal, las fibras nerviosas sensoriales marcadas se siguieron completamente a una distancia más larga, corriendo en haces en la capa cutánea profunda y freestyle en la capa superficial. Estas fibras nerviosas corrían en paralelo o rodeaban los vasos sanguíneos, y los vasos linfáticos formaban una red tridimensional (3D) en la piel peluda y glabra. El protocolo actual proporciona un enfoque más efectivo para estudiar la inervación de la piel que los métodos convencionales existentes desde la perspectiva de la metodología.
Introduction
La piel, el órgano más grande del cuerpo, que sirve como una interfaz clave para el medio ambiente, está densamente inervada por muchas fibras nerviosas 1,2,3. Aunque la inervación de la piel ha sido ampliamente estudiada previamente con varios métodos histológicos, como la tinción en las secciones 4,5,6 de la piel y el tejido de montaje completo, la demostración efectiva detallada de las fibras nerviosas cutáneas sigue siendo un desafío 7,8. Dado esto, el presente protocolo desarrolló una técnica única para exhibir las fibras nerviosas cutáneas más claramente en la sección de tejido grueso.
Debido al límite por el grosor de las secciones, la observación de las fibras nerviosas inervadas de la piel no es lo suficientemente precisa como para representar con precisión la relación entre las fibras nerviosas del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y los tejidos y órganos locales a partir de la información de la imagen adquirida. La aparición de la tecnología de limpieza de tejidos en 3D proporciona un método factible para resolver este problema 9,10. El rápido desarrollo de enfoques de limpieza de tejidos ha ofrecido muchas herramientas para estudiar estructuras tisulares, órganos enteros, proyecciones neuronales y animales enteros en los últimos tiempos11. El tejido transparente de la piel podría ser fotografiado en una sección mucho más gruesa por microscopía confocal para obtener los datos para visualizar las fibras nerviosas cutáneas.
En el estudio actual, la piel plantar y dorsal de un pie trasero de rata se seleccionó como los dos sitios objetivo de la piel peluda y glabra 3,4,7. Para rastrear las fibras nerviosas cutáneas a una distancia más larga, el tejido de la piel se cortó en rodajas con un grosor de 300 μm para la tinción inmunohistoquímica e histoquímica, seguida de un tratamiento de limpieza de tejidos. CGRP se utilizó para etiquetar las fibras nerviosas sensoriales12,13. Además, para resaltar las fibras nerviosas cutáneas en el fondo tisular, la faloidina y el receptor 1 de hialuronano endotelial de vasos linfáticos (LYVE1) se utilizaron para etiquetar los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos, respectivamente14,15.
Estos enfoques proporcionaron un método sencillo que se puede aplicar para demostrar una vista de alta resolución de las fibras nerviosas cutáneas y también para visualizar la correlación espacial entre las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la piel, lo que puede proporcionar mucha más información para comprender la homeostasis de la piel normal y la alteración cutánea en las condiciones patológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente estudio proporciona una demostración detallada de las fibras nerviosas cutáneas en la piel peluda y glabra mediante el uso de inmunofluorescencia en secciones de tejido más gruesas con tratamiento de limpieza y una vista 3D para comprender mejor la inervación de la piel. El tiempo de incubación de anticuerpos de hasta 1-2 días y un proceso de limpieza nocturno son importantes. Estos dos pasos clave afectan directamente el efecto de tinción de inmunofluorescencia de secciones gruesas. Otro problema surg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Fondo de Innovación de la Academia China de Ciencias Médicas (Código de Proyecto no. CI2021A03404) y el Fondo Nacional de Innovación Interdisciplinaria de Medicina Tradicional China (Código del Proyecto no. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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