JoVE Journal > Engineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Engineering

Yüksek Verimli Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Kontrollü Kalınlığa Sahip Mikro Desenli Çip İmalatı

Published: April 21, 2022
doi:
10.3791/63739
, , ,
1Department of Biomedical-Chemical Engineering,The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology,The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes,Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research,Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering,Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology,Seoul National University

Summary

Grafen oksit pencereli yeni geliştirilen mikro desenli çip, mikroelektromekanik sistem teknikleri uygulanarak üretilir ve çeşitli biyomoleküllerin ve nanomalzemelerin verimli ve yüksek verimli kriyojenik elektron mikroskopisi görüntülemesini sağlar.

Abstract

Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanılarak biyomoleküllerin verimli ve yüksek verimli yapı analizi için önemli bir sınırlama, nano ölçekte kontrollü buz kalınlığına sahip kriyo-EM numunelerinin hazırlanmasının zorluğudur. Kalınlığı kontrol edilen silikon nitrür (SixNy) filmi üzerine desenli grafen oksit (GO) pencereli düzenli bir mikro delik dizisine sahip olan silikon (Si) bazlı çip, mikroelektromekanik sistem (MEMS) teknikleri uygulanarak geliştirilmiştir. UV fotolitografisi, kimyasal buhar birikimi, ince filmin ıslak ve kuru aşındırılması ve 2D nanosheet malzemelerin damla dökümü, GO pencereli mikro desenli çiplerin seri üretimi için kullanılmıştır. Mikro deliklerin derinliği, kriyo-EM analizi için numunenin boyutuna bağlı olarak, talep üzerine buz kalınlığını kontrol etmek için düzenlenir. GO’nun biyomoleküllere olan olumlu afinitesi, kriyo-EM numune hazırlama sırasında ilgilenilen biyomolekülleri mikro delik içinde yoğunlaştırır. GO pencereli mikro desenli çip, çeşitli biyolojik moleküllerin yanı sıra inorganik nanomalzemelerin yüksek verimli kriyo-EM görüntülemesini sağlar.

Introduction

Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM), proteinlerin üç boyutlu (3D) yapısını doğal hallerinde 1,2,3,4 olarak çözmek için geliştirilmiştir. Teknik, proteinleri ince bir vitreus buzu tabakasına (10-100 nm) sabitlemeyi ve bir iletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak rastgele yönlendirilmiş proteinlerin projeksiyon görüntülerini elde etmeyi içerir. Binlerce ila milyonlarca projeksiyon görüntüsü elde edilir ve hesaplama algoritmaları ile proteinin 3B yapısını yeniden yapılandırmak için kullanılır 5,6. Cryo-EM ile başarılı bir analiz için, kriyo-numune hazırlama, lekelenme koşullarını, nemi ve sıcaklığı kontrol eden ekipmanın daldırılması-dondurulmasıyla otomatikleştirilmiştir. Numune çözeltisi, delikli bir karbon membranlı bir TEM ızgarasına yüklenir, fazla çözeltiyi gidermek için art arda lekelenir ve daha sonra ince, vitreus buz 1,5,6 üretmek için sıvı etan ile dondurularak dondurulur. Kriyo-EM’deki gelişmeler ve numune hazırlama7’nin otomasyonu ile kriyo-EM, virüsler için zarf proteinleri ve hücre zarındaki iyon kanalı proteinleri de dahil olmak üzere proteinlerin yapısını çözmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır 8,9,10. Patojenik viral partiküllerin zarf proteinlerinin yapısı, viral enfeksiyon patolojisini anlamanın yanı sıra,COVID-19 pandemisine neden olan SARS-CoV-2 11 gibi tanı sistemini ve aşıları geliştirmek için önemlidir. Ayrıca, kriyo-EM teknikleri son zamanlarda pil12,13,14 ve katalitiksistemler 14,15’te kullanılan ışına duyarlı malzemelerin görüntülenmesi ve inorganik malzemelerin 16 çözelti halindeki yapısının analiz edilmesi gibi malzeme bilimlerine uygulanmıştır.

Kriyo-EM ve ilgili tekniklerdeki gözle görülür gelişmelere rağmen, kriyo-numune hazırlamada sınırlamalar vardır ve bu da yüksek verimli 3D yapı analizini engellemektedir. Optimum kalınlığa sahip bir vitreus buz filmi hazırlamak, biyolojik malzemelerin atomik çözünürlüğe sahip 3D yapısını elde etmek için özellikle önemlidir. Buz, buz tarafından dağılan elektronlardan gelen arka plan gürültüsünü en aza indirecek ve elektron ışını yolu1,17 boyunca biyomoleküllerin üst üste binmesini yasaklamak için yeterince ince olmalıdır. Bununla birlikte, buz çok inceyse, protein moleküllerinin tercih edilen yönlerde hizalanmasına veya 18,19,20’yi denatüre etmesine neden olabilir. Bu nedenle, vitreus buzunun kalınlığı, ilgilenilen malzemenin boyutuna bağlı olarak optimize edilmelidir. Ayrıca, numune hazırlanması ve hazırlanan TEM ızgaralarında buz ve protein bütünlüğünün manuel olarak taranması için tipik olarak kapsamlı çaba gereklidir. Bu süreç son derece zaman alıcıdır ve bu da yüksek verimli 3D yapı analizi için verimliliğini engeller. Bu nedenle, kriyo-EM numune hazırlamanın güvenilirliği ve tekrarlanabilirliğindeki gelişmeler, kriyo-EM’nin yapısal biyoloji ve ticari ilaç keşfinde ve ayrıca malzeme biliminde kullanımını artıracaktır.

Burada, kontrollü buz kalınlığı21 ile yüksek verimli kriyo-EM için tasarlanmış grafen oksit (GO) pencereli mikro desenli bir çip yapmak için mikrofabrikasyon süreçlerini tanıtıyoruz. Mikro desenli çip, görüntüleme amaçlarına bağlı olarak çipin yapısını ve boyutlarını manipüle edebilen mikroelektromekanik sistem (MEMS) teknikleri kullanılarak üretilmiştir. GO pencereli mikro desenli çip, numune çözeltisi ile doldurulabilen bir mikro kuyucuk yapısına sahiptir ve vitreus buzunun kalınlığını kontrol etmek için mikro kuyucuğun derinliği düzenlenebilir. GO’nun biyomoleküller için güçlü afinitesi, görselleştirme için biyomoleküllerin konsantrasyonunu arttırır ve yapı analizinin verimliliğini arttırır. Ayrıca, mikro desenli çip, ızgara19 için yüksek mekanik stabilite sağlayan bir Si çerçevesinden oluşur ve bu da numune hazırlama prosedürleri ve kriyo-EM görüntüleme sırasında çipin işlenmesi için idealdir. Bu nedenle, MEMS teknikleri tarafından üretilen GO pencereli mikro desenli bir çip, kriyo-EM numune hazırlamanın güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlar, bu da kriyo-EM’ye dayalı verimli ve yüksek verimli yapı analizini mümkün kılar.

Protocol

1. GO pencereli mikro desenli çip imalatı (Şekil 1) Silisyum nitrürü biriktirin.830 ° C’de düşük basınçlı kimyasal buhar biriktirme (LPCVD) ve 150 mTorr basınç kullanarak, 170 sccm diklorosilane (SiH2Cl2, DCS) ve 38 sccm amonyak (NH3) akışı altında Si gofretin her iki tarafında (4 inç çapında ve 100 μm kalınlıkta) düşük gerilimli silikon nitrür (SixNy) birik…

Representative Results

GO pencereli mikro desenli bir çip, MEMS üretimi ve 2D GO nanosheet transferi ile üretildi. Mikro modelleme için çipler seri olarak üretildi ve gofretteki bir 4’ten yaklaşık 500 çip üretildi (Şekil 1B ve Şekil 2A, B). Mikro desenli çiplerin tasarımları, fotolitografi prosedürü sırasında krom maskesinin farklı tasarımları kullanılarak manipüle edilebilir (Şekil 2). Fabrikasyon mikro desenli ?…

Discussion

GO pencereli mikro desenli çipler üretmek için mikrofabrikasyon süreçleri burada tanıtılmaktadır. Fabrikasyon mikro desenli çip, analiz edilecek malzemenin boyutuna bağlı olarak mikro deliğin derinliğini GO pencereleri ile kontrol ederek vitreus buz tabakasının kalınlığını düzenlemek için tasarlanmıştır. GO pencereli mikro desenli bir çip, bir dizi MEMS tekniği ve bir 2D nanosheet transfer yöntemi kullanılarak üretildi (Şekil 1). MEMS imalat tekniğini kullanma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.-H.K., S.K., M.L. ve J.P., Temel Bilimler Enstitüsü’nün mali desteğini kabul etmektedir (Hibe No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. ve J.P., Seul Ulusal Üniversitesi (2021) aracılığıyla Yaratıcı-Öncü Araştırmacılar Programı’nın finansal desteğini ve Kore hükümeti tarafından finanse edilen NRF hibesini (MSIT; Hibe No. NMG-2020R1A2C2101871 ve NMG-2021M3A9I4022936). M.L. ve J.P., POSCO TJ Park Vakfı’nın POSCO Bilim Bursu’nun mali desteğini ve Kore hükümeti tarafından finanse edilen NMK hibesini (MSIT; Hibe No. NMG-2017R1A5A1015365). J.P., Kore hükümeti (MSIT; Hibe No. NMK-2020R1A6C101A183) ve Seul Ulusal Üniversitesi Mühendislik Fakültesi ve Tıp Fakültesi tarafından Disiplinlerarası Araştırma Girişimleri Programları (2021). M.-H.K., Kore hükümeti (MSIT; Hibe No. NMG-2020R1I1A1A0107416612). Yazarlar, Seul Ulusal Üniversitesi Makromoleküler ve Hücre Görüntüleme Merkezi (SNU CMCI) personeline ve ekibine, kriyo-EM deneyleri ile yorulmak bilmeyen çabaları ve azimleri için teşekkür eder. Yazarlar, FIB-SEM deneylerine yardım için Ulusal Üniversitelerarası Araştırma Tesisleri Merkezi’nden S. J. Kim’e teşekkür ediyor.

Materials

1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Tags

Micro-patterned ChipControlled ThicknessHigh-throughput Cryogenic Electron MicroscopyMEMS FabricationSilicon Nitride MembranePhotoresist PatterningReactive Ion EtchingPotassium Hydroxide Etching3D Structure AnalysisBiomoleculesDrug Discovery

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kang, M., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image