تصنيع رقاقة ذات نقوش دقيقة بسماكة يتم التحكم فيها للفحص المجهري الإلكتروني المبرد عالي الإنتاجية
Summary
يتم تصنيع رقاقة صغيرة منقوشة تم تطويرها حديثا مع نوافذ أكسيد الجرافين من خلال تطبيق تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق ، مما يتيح التصوير المجهري الإلكتروني المبرد الفعال وعالي الإنتاجية لمختلف الجزيئات الحيوية والمواد النانوية.
Abstract
أحد القيود الرئيسية على تحليل بنية الجزيئات الحيوية بكفاءة وإنتاجية عالية باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) هو صعوبة إعداد عينات cryo-EM بسماكة جليد خاضعة للرقابة على المستوى النانوي. تم تطوير الشريحة القائمة على السيليكون (Si) ، والتي تحتوي على مجموعة منتظمة من الثقوب الدقيقة مع نافذة أكسيد الجرافين (GO) المنقوشة على فيلم نيتريد السيليكون الذي يتم التحكم فيه بسماكة (SixNy) ، من خلال تطبيق تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق (MEMS). تم استخدام الطباعة الحجرية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية ، وترسب البخار الكيميائي ، والنقش الرطب والجاف للفيلم الرقيق ، وصب الصفائح النانوية 2D للإنتاج الضخم للرقائق ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO. يتم تنظيم عمق الثقوب الدقيقة للتحكم في سمك الجليد عند الطلب ، اعتمادا على حجم العينة لتحليل cryo-EM. يركز التقارب الإيجابي ل GO تجاه الجزيئات الحيوية على الجزيئات الحيوية ذات الأهمية داخل الثقب الصغير أثناء إعداد عينة cryo-EM. تتيح الشريحة ذات النقوش الدقيقة المزودة بنوافذ GO التصوير بالتبريد EM عالي الإنتاجية لمختلف الجزيئات البيولوجية ، بالإضافة إلى المواد النانوية غير العضوية.
Introduction
تم تطوير المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) لحل البنية ثلاثية الأبعاد (3D) للبروتينات في حالتها الأصلية1،2،3،4. تتضمن هذه التقنية تثبيت البروتينات في طبقة رقيقة (10-100 نانومتر) من الجليد الزجاجي والحصول على صور إسقاط للبروتينات الموجهة عشوائيا باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، مع الحفاظ على العينة عند درجة حرارة النيتروجين السائل. يتم الحصول على الآلاف إلى الملايين من صور الإسقاط واستخدامها لإعادة بناء بنية ثلاثية الأبعاد للبروتين بواسطة خوارزميات حسابية 5,6. للحصول على تحليل ناجح باستخدام cryo-EM ، تم أتمتة إعداد عينات التبريد عن طريق تجميد المعدات التي تتحكم في ظروف النشاف والرطوبة ودرجة الحرارة. يتم تحميل محلول العينة على شبكة TEM بغشاء كربوني هولي ، ويتم لطخه على التوالي لإزالة المحلول الزائد ، ثم يتم تجميده بالإيثان السائل لإنتاج جليد زجاجي رقيق 1,5,6. مع التقدم في cryo-EM وأتمتة إعداد العينات7 ، تم استخدام cryo-EM بشكل متزايد لحل بنية البروتينات ، بما في ذلك البروتينات المغلفة للفيروسات وبروتينات القناة الأيونية في غشاء الخلية 8,9,10. يعد هيكل البروتينات المغلفة للجسيمات الفيروسية المسببة للأمراض أمرا مهما لفهم أمراض العدوى الفيروسية ، وكذلك تطوير نظام التشخيص واللقاحات على سبيل المثال ، SARS-CoV-2 11 ، الذي تسبب في جائحةCOVID-19. علاوة على ذلك ، تم تطبيق تقنيات cryo-EM مؤخرا على علوم المواد ، مثل تصوير المواد الحساسة للشعاع المستخدمة في البطارية12،13،14 والأنظمة التحفيزية14،15 وتحليل بنية المواد غير العضوية في حالة الحل 16.
على الرغم من التطورات الملحوظة في cryo-EM والتقنيات ذات الصلة ، توجد قيود في إعداد عينات التبريد ، مما يعوق تحليل بنية 3D عالية الإنتاجية. يعد إعداد فيلم ثلج زجاجي بسماكة مثالية أمرا مهما بشكل خاص للحصول على بنية 3D للمواد البيولوجية بدقة ذرية. يجب أن يكون الجليد رقيقا بما يكفي لتقليل ضوضاء الخلفية من الإلكترونات المتناثرة بواسطة الجليد ولمنع تداخل الجزيئات الحيوية على طول مسار شعاع الإلكترون 1,17. ومع ذلك ، إذا كان الجليد رقيقا جدا ، فقد يتسبب في محاذاة جزيئات البروتين في الاتجاهات المفضلة أو تشويه18،19،20. لذلك ، يجب تحسين سمك الجليد الزجاجي اعتمادا على حجم المادة ذات الاهتمام. علاوة على ذلك ، عادة ما تكون هناك حاجة إلى جهد مكثف لإعداد العينات والفحص اليدوي لسلامة الجليد والبروتين على شبكات TEM المعدة. هذه العملية تستغرق وقتا طويلا للغاية ، مما يعوق كفاءتها لتحليل هيكل 3D عالي الإنتاجية. ولذلك، فإن التحسينات في موثوقية وقابلية استنساخ إعداد عينات التبريد EM من شأنها أن تعزز استخدام cryo-EM في البيولوجيا الهيكلية واكتشاف الأدوية التجارية، وكذلك لعلوم المواد.
هنا ، نقدم عمليات التصنيع الدقيق لصنع شريحة ذات نقوش دقيقة مع نوافذ أكسيد الجرافين (GO) المصممة ل cryo-EM عالي الإنتاجية مع سمك الجليد المتحكم فيه21. تم تصنيع الشريحة ذات النقوش الدقيقة باستخدام تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق (MEMS) ، والتي يمكنها التعامل مع بنية وأبعاد الشريحة اعتمادا على أغراض التصوير. تحتوي الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO على بنية microwell يمكن ملؤها بمحلول العينة ، ويمكن تنظيم عمق البئر الصغير للتحكم في سمك الجليد الزجاجي. يعزز التقارب القوي ل GO للجزيئات الحيوية تركيز الجزيئات الحيوية للتصور ، مما يحسن كفاءة تحليل الهيكل. علاوة على ذلك ، تتكون الشريحة ذات النقوش الدقيقة من إطار Si ، والذي يوفر استقرارا ميكانيكيا عاليا للشبكة19 ، مما يجعلها مثالية للتعامل مع الشريحة أثناء إجراءات إعداد العينات والتصوير بالتبريد EM. لذلك ، توفر الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO المصنعة بواسطة تقنيات MEMS الموثوقية والتكرار لإعداد عينات cryo-EM ، والتي يمكن أن تمكن من تحليل هيكل فعال وعالي الإنتاجية استنادا إلى cryo-EM.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تقديم عمليات التصنيع الدقيق لإنتاج رقائق صغيرة مع نوافذ GO هنا. تم تصميم الشريحة الدقيقة المصنعة لتنظيم سمك طبقة الجليد الزجاجية من خلال التحكم في عمق الثقب الصغير باستخدام نوافذ GO اعتمادا على حجم المادة المراد تحليلها. تم تصنيع شريحة صغيرة النقوش مع نوافذ GO باستخدام سلسلة من تقنيات MEMS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر M.-H.K.، S.K.، M.L.، و J.P. بالدعم المالي المقدم من معهد العلوم الأساسية (رقم المنحة. IBS-R006-D1). تعترف S.K. ، M.L. ، و J.P. بالدعم المالي المقدم من برنامج الباحثين المبدعين الرائدين من خلال جامعة سيول الوطنية (2021) ومنحة NRF الممولة من الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة. NRF-2020R1A2C2101871 ، و NRF-2021M3A9I4022936). M.L. و J.P. يقترفان بالدعم المالي المقدم من زمالة POSCO للعلوم التابعة لمؤسسة POSCO TJ Park ومنحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2017R1A5A1015365). يقر J.P. بالدعم المالي المقدم من منحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2020R1A6C101A183)، وبرامج المبادرات البحثية متعددة التخصصات من قبل كلية الهندسة وكلية الطب، جامعة سيول الوطنية (2021). يقر M.-H.K. بالدعم المالي المقدم من منحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2020R1I1A1A0107416612). يشكر المؤلفون موظفي وطاقم مركز جامعة سيول الوطنية للتصوير الجزيئي والخلوي (SNU CMCI) على جهودهم الدؤوبة ومثابرتهم في تجارب cryo-EM. يشكر المؤلفون S. J. Kim من المركز الوطني لمرافق البحوث المشتركة بين الجامعات للمساعدة في تجارب FIB-SEM.
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
References
- Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
- Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
- Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
- Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
- Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
- Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
- Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
- Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
- Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
- Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
- Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
- Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
- Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
- Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
- Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
- Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
- Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
- Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
- Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
- Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).
