Fabricage van micro-patroonchip met gecontroleerde dikte voor cryogene elektronenmicroscopie met hoge doorvoer
Summary
Een nieuw ontwikkelde chip met micropatroon met grafeenoxidevensters wordt vervaardigd door micro-elektromechanische systeemtechnieken toe te passen, waardoor efficiënte en high-throughput cryogene elektronenmicroscopiebeeldvorming van verschillende biomoleculen en nanomaterialen mogelijk wordt.
Abstract
Een belangrijke beperking voor de efficiënte en high-throughput structuuranalyse van biomoleculen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is de moeilijkheid om cryo-EM-monsters met gecontroleerde ijsdikte op nanoschaal voor te bereiden. De op silicium (Si) gebaseerde chip, die een regelmatige reeks microgaten met grafeenoxide (GO) venster heeft met een patroon op een dikte-gecontroleerde siliciumnitride (SixNy) film, is ontwikkeld door micro-elektromechanische systeem (MEMS) technieken toe te passen. UV-fotolithografie, chemische dampafzetting, nat en droog etsen van de dunne film en drop-casting van 2D nanosheet-materialen werden gebruikt voor massaproductie van de micro-patroonchips met GO-vensters. De diepte van de microgaten wordt geregeld om de ijsdikte op aanvraag te regelen, afhankelijk van de grootte van het monster voor cryo-EM-analyse. De gunstige affiniteit van GO voor biomoleculen concentreert de biomoleculen van belang in het microgat tijdens cryo-EM-monstervoorbereiding. De chip met micropatroon met GO-vensters maakt cryo-EM-beeldvorming met hoge doorvoer van verschillende biologische moleculen mogelijk, evenals anorganische nanomaterialen.
Introduction
Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is ontwikkeld om de driedimensionale (3D) structuur van eiwitten in hun oorspronkelijke toestand op te lossen 1,2,3,4. De techniek omvat het fixeren van eiwitten in een dunne laag (10-100 nm) glasachtig ijs en het verkrijgen van projectiebeelden van willekeurig georiënteerde eiwitten met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM), waarbij het monster op vloeibare stikstoftemperatuur wordt gehouden. Duizenden tot miljoenen projectiebeelden worden verkregen en gebruikt om een 3D-structuur van het eiwit te reconstrueren door computationele algoritmen 5,6. Voor een succesvolle analyse met cryo-EM is de voorbereiding van cryomonsters geautomatiseerd door de apparatuur die de blottingcondities, vochtigheid en temperatuur regelt, te dopen. De monsteroplossing wordt op een TEM-rooster geladen met een gatvormig koolstofmembraan, achtereenvolgens uitgeveegd om de overtollige oplossing te verwijderen en vervolgens ingevroren met vloeibaar ethaan om dun, glasachtig ijs te produceren 1,5,6. Met de vooruitgang in cryo-EM en de automatisering van monstervoorbereiding7, is cryo-EM steeds vaker gebruikt om de structuur van eiwitten op te lossen, inclusief envelopeiwitten voor virussen en ionkanaaleiwitten in het celmembraan 8,9,10. De structuur van enveloppe-eiwitten van pathogene virale deeltjes is belangrijk voor het begrijpen van virale infectiepathologie, evenals het ontwikkelen van het diagnosesysteem en vaccins, bijvoorbeeld SARS-CoV-211, die de COVID-19-pandemie hebben veroorzaakt. Bovendien zijn cryo-EM-technieken onlangs toegepast op materiaalwetenschappen, zoals voor het afbeelden van bundelgevoelige materialen die worden gebruikt in batterij 12,13,14 en katalytische systemen 14,15 en het analyseren van de structuur van anorganische materialen in oplossingstoestand16.
Ondanks merkbare ontwikkelingen in cryo-EM en relevante technieken, zijn er beperkingen in cryo-monstervoorbereiding, waardoor high-throughput 3D-structuuranalyse wordt belemmerd. Het bereiden van een glasachtige ijsfilm met optimale dikte is vooral belangrijk voor het verkrijgen van de 3D-structuur van biologische materialen met atomaire resolutie. Het ijs moet dun genoeg zijn om de achtergrondruis van elektronen die door het ijs worden verstrooid te minimaliseren en overlappingen van biomoleculen langs het elektronenbundelpad te voorkomen 1,17. Als het ijs echter te dun is, kan dit ervoor zorgen dat eiwitmoleculen in voorkeursoriëntaties uitlijnen of 18,19,20 denatureren. Daarom moet de dikte van glasachtig ijs worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de grootte van het materiaal van belang. Bovendien is meestal uitgebreide inspanning nodig voor de monstervoorbereiding en handmatige screening van ijs- en eiwitintegriteit op de voorbereide TEM-roosters. Dit proces is extreem tijdrovend, wat de efficiëntie ervan voor 3D-structuuranalyse met hoge doorvoer belemmert. Daarom zouden verbeteringen in de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van cryo-EM-monstervoorbereiding het gebruik van cryo-EM in de structurele biologie en commerciële geneesmiddelenontdekking verbeteren, evenals voor materiaalwetenschap.
Hierin introduceren we microfabricageprocessen voor het maken van een chip met micropatroon met grafeenoxide (GO) ramen die zijn ontworpen voor cryo-EM met hoge doorvoer met gecontroleerde ijsdikte21. De chip met micro-patroon werd vervaardigd met behulp van micro-elektromechanische systeem (MEMS) technieken, die de structuur en afmetingen van de chip kunnen manipuleren, afhankelijk van de beeldvormingsdoeleinden. De chip met micropatroon met GO-vensters heeft een microwellstructuur die kan worden gevuld met de monsteroplossing en de diepte van de microwell kan worden geregeld om de dikte van het glasvochtijs te regelen. De sterke affiniteit van GO voor biomoleculen verbetert de concentratie van biomoleculen voor visualisatie, waardoor de efficiëntie van de structuuranalyse wordt verbeterd. Bovendien bestaat de chip met micropatroon uit een Si-frame, dat een hoge mechanische stabiliteit biedt voor het raster19, waardoor het ideaal is voor het hanteren van de chip tijdens monstervoorbereidingsprocedures en cryo-EM-beeldvorming. Daarom biedt een chip met micropatroon met GO-vensters vervaardigd door MEMS-technieken betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van cryo-EM-monstervoorbereiding, wat een efficiënte en high-throughput structuuranalyse op basis van cryo-EM mogelijk kan maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De microfabricageprocessen voor het produceren van micro-patroonchips met GO-vensters worden hier geïntroduceerd. De gefabriceerde chip met micropatroon is ontworpen om de dikte van de glasachtige ijslaag te regelen door de diepte van het microgat met GO-ramen te regelen, afhankelijk van de grootte van het te analyseren materiaal. Een chip met micropatroon met GO-vensters werd vervaardigd met behulp van een reeks MEMS-technieken en een 2D-nanosheet-overdrachtsmethode (figuur 1). Het grote v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-H.K., S.K., M.L. en J.P. erkennen de financiële steun van het Institute for Basic Science (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. en J.P. erkennen de financiële steun van het Creative-Pioneering Researchers Program via Seoul National University (2021) en de NRF-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT; Subsidie nrs. NRF-2020R1A2C2101871 en NRF-2021M3A9I4022936). M.L. en J.P. erkennen de financiële steun van de POSCO Science Fellowship van POSCO TJ Park Foundation en de NRF-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT; Subsidie nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. erkent de financiële steun van de NRF-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT; Subsidie nr. NRF-2020R1A6C101A183) en de interdisciplinaire onderzoeksinitiatievenprogramma’s van college of engineering en college of medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. erkent de financiële steun van de NRF-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT; Subsidie nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). De auteurs bedanken het personeel en de bemanning van het Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) voor hun onvermoeibare inspanningen en doorzettingsvermogen met de cryo-EM-experimenten. De auteurs bedanken S. J. Kim van het National Center for Inter-university Research Facilities voor hulp bij de FIB-SEM-experimenten.
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
References
- Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
- Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
- Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
- Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
- Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
- Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
- Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
- Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
- Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
- Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
- Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
- Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
- Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
- Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
- Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
- Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
- Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
- Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
- Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
- Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).
