Изготовление микроструктурированного чипа с контролируемой толщиной для высокопроизводительной криогенной электронной микроскопии
Summary
Недавно разработанный микроструктурированный чип с окнами оксида графена изготовлен с применением методов микроэлектромеханической системы, что позволяет эффективно и высокопроизводительно криогенную электронную микроскопию визуализировать различные биомолекулы и наноматериалы.
Abstract
Основным ограничением для эффективного и высокопроизводительного структурного анализа биомолекул с использованием криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ) является сложность подготовки крио-ЭМ образцов с контролируемой толщиной льда на наноуровне. Микросхема на основе кремния (Si), которая имеет регулярный массив микроотверстей с окном оксида графена (GO), узорчатым на пленке нитрида кремния с контролируемой толщиной (SixNy), была разработана с применением методов микроэлектромеханической системы (MEMS). УФ-фотолитография, химическое осаждение из паровой фазы, мокрое и сухое травление тонкой пленки, капельное литье 2D нанолистовых материалов использовались для массового производства микроструктурированных чипов с окнами GO. Глубина микроотверстей регулируется для контроля толщины льда по требованию, в зависимости от размера образца для крио-ЭМ-анализа. Благоприятное сродство GO к биомолекулам концентрирует биомолекулы, представляющие интерес, в микро-отверстии во время крио-ЭМ пробоподготовки. Микроструктурированный чип с окнами GO обеспечивает высокопроизводительную крио-ЭМ визуализацию различных биологических молекул, а также неорганических наноматериалов.
Introduction
Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) была разработана для разрешения трехмерной (3D) структуры белков в их родном состоянии 1,2,3,4. Метод включает фиксацию белков в тонком слое (10-100 нм) стекловидного льда и получение проекционных изображений случайно ориентированных белков с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЭМ), при этом образец поддерживается при температуре жидкого азота. Тысячи и миллионы проекционных изображений получены и использованы для реконструкции 3D-структуры белка с помощью вычислительных алгоритмов 5,6. Для успешного анализа с помощью крио-ЭМ криоподготовка образцов была автоматизирована путем погружной заморозки оборудования, которое контролирует условия блоттинга, влажность и температуру. Образец раствора загружают на сетку ТЭМ с дырявой углеродной мембраной, последовательно промокают для удаления избытка раствора, а затем погружают-замораживают жидким этаном для получения тонкого стекловидного льда 1,5,6. С достижениями в области крио-ЭМ и автоматизации пробоподготовки7 крио-ЭМ все чаще используется для решения структуры белков, включая белки оболочки для вирусов и белки ионных каналов в клеточной мембране 8,9,10. Структура белков оболочки патогенных вирусных частиц важна для понимания патологии вирусной инфекции, а также разработки системы диагностики и вакцин, например, SARS-CoV-211, вызвавшего пандемию COVID-19. Кроме того, крио-ЭМ методы недавно были применены в материаловедении, например, для визуализации чувствительных к пучку материалов, используемых в батареях 12,13,14 и каталитических системах 14,15, и анализа структуры неорганических материалов в состоянии раствора16.
Несмотря на заметные изменения в крио-ЭМ и соответствующих методах, существуют ограничения в крио-пробоподготовке, препятствующие высокопроизводительному 3D-анализу структуры. Получение стекловидной ледяной пленки с оптимальной толщиной особенно важно для получения 3D-структуры биологических материалов с атомным разрешением. Лед должен быть достаточно тонким, чтобы минимизировать фоновый шум от электронов, рассеянных льдом, и запретить перекрытие биомолекул вдоль траектории электронного пучка 1,17. Однако, если лед слишком тонкий, это может привести к тому, что белковые молекулы выровняются в предпочтительных ориентациях или денатурируют 18,19,20. Поэтому толщина стекловидного льда должна быть оптимизирована в зависимости от размера интересующего материала. Кроме того, обычно требуются значительные усилия для подготовки образцов и ручного скрининга целостности льда и белка на подготовленных сетках ТЕА. Этот процесс чрезвычайно трудоемкий, что снижает его эффективность для высокопроизводительного анализа 3D-структур. Таким образом, повышение надежности и воспроизводимости крио-ЭМ пробоподготовки улучшит использование крио-ЭМ в структурной биологии и коммерческом открытии лекарств, а также в материаловедении.
Здесь мы вводим процессы микрофабрикации для изготовления микроструктурированного чипа с окнами оксида графена (GO), предназначенного для высокопроизводительной крио-ЭМ с контролируемой толщиной льда21. Микроструктурный чип был изготовлен с использованием методов микроэлектромеханической системы (MEMS), которые могут манипулировать структурой и размерами чипа в зависимости от целей визуализации. Микроструктурированный чип с окнами GO имеет структуру микролунки, которая может быть заполнена раствором образца, а глубина микролунки может регулироваться для контроля толщины стекловидного льда. Сильное сродство GO к биомолекулам повышает концентрацию биомолекул для визуализации, повышая эффективность структурного анализа. Кроме того, микроструктурированный чип состоит из Si-кадра, который обеспечивает высокую механическую стабильность сетки19, что делает его идеальным для обработки чипа во время процедур подготовки образцов и крио-ЭМ визуализации. Таким образом, микроструктурированный чип с окнами GO, изготовленными по методам MEMS, обеспечивает надежность и воспроизводимость крио-ЭМ пробоподготовки, что может обеспечить эффективный и высокопроизводительный анализ структуры на основе крио-ЭМ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлены процессы микрофабрикации для производства микроструктурированных чипов с окнами GO. Изготовленный микроструктурированный чип предназначен для регулирования толщины стекловидного слоя льда путем контроля глубины микроотверстия с помощью окон GO в зависимости от р?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-H.K., S.K., M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны Института фундаментальных наук (грант No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны Creative-Pioneering Researchers Program через Сеульский национальный университет (2021) и грант NRF, финансируемый корейским правительством (MSIT; Грант Nos. NRF-2020R1A2C2101871 и NRF-2021M3A9I4022936). M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны POSCO Science Fellowship of POSCO TJ Park Foundation и грант NRF, финансируемый корейским правительством (MSIT; Номер гранта НРФ-2017R1A5A1015365). J.P. признает финансовую поддержку из гранта NRF, финансируемого корейским правительством (MSIT; Номер гранта NRF-2020R1A6C101A183) и междисциплинарные исследовательские инициативные программы Инженерного колледжа и Медицинского колледжа Сеульского национального университета (2021). M.-H.K. признает финансовую поддержку из гранта NRF, финансируемого корейским правительством (MSIT; Номер гранта НРФ-2020R1I1A1A0107416612). Авторы благодарят сотрудников и экипаж Центра макромолекулярной и клеточной визуализации Сеульского национального университета (SNU CMCI) за их неустанные усилия и настойчивость в крио-ЭМ-экспериментах. Авторы благодарят S. J. Kim из Национального центра межуниверситетских исследовательских учреждений за помощь в экспериментах FIB-SEM.
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
References
- Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
- Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
- Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
- Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
- Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
- Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
- Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
- Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
- Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
- Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
- Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
- Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
- Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
- Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
- Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
- Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
- Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
- Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
- Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
- Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).
