ייצור שבב מיקרו-תבניתי בעובי מבוקר למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה
Summary
שבב מיקרו-תבניתי שפותח לאחרונה עם חלונות תחמוצת גרפן מיוצר על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית, המאפשרות הדמיה יעילה ובעלת תפוקה גבוהה של מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה של ביומולקולות וננו-חומרים שונים.
Abstract
מגבלה מרכזית לניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) היא הקושי להכין דגימות cryo-EM עם עובי קרח מבוקר בקנה מידה ננומטרי. השבב מבוסס הסיליקון (Si), בעל מערך קבוע של מיקרו-חורים עם חלון תחמוצת גרפן (GO) המעוצב על סרט סיליקון ניטריד מבוקר עובי (Six Ny), פותח על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית (MEMS). פוטוליתוגרפיה של UV, תצהיר אדים כימיים, תחריט רטוב ויבש של הסרט הדק, ויציקת טיפות של חומרי ננו-יריעה דו-ממדיים שימשו לייצור המוני של השבבים בעלי התבניות הזעירות עם חלונות GO. עומק החורים הזעירים מווסת כדי לשלוט בעובי הקרח לפי דרישה, בהתאם לגודל הדגימה לצורך ניתוח cryo-EM. הזיקה החיובית של GO לביו-מולקולות מרכזת את הביומולקולות המעניינות בתוך החור המיקרו במהלך הכנת דגימת cryo-EM. השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO מאפשר הדמיית cryo-EM בתפוקה גבוהה של מולקולות ביולוגיות שונות, כמו גם ננו-חומרים אנאורגניים.
Introduction
מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) פותחה כדי לפתור את המבנה התלת-ממדי (התלת-ממדי) של חלבונים במצבם הטבעי 1,2,3,4. הטכניקה כוללת קיבוע חלבונים בשכבה דקה (10-100 ננומטר) של קרח זגוגי ורכישת תמונות הקרנה של חלבונים בעלי אוריינטציה אקראית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), כאשר הדגימה נשמרת בטמפרטורת חנקן נוזלי. אלפי עד מיליוני תמונות הקרנה נרכשות ומשמשות לשחזור מבנה תלת-ממדי של החלבון על ידי אלגוריתמים חישוביים 5,6. לצורך ניתוח מוצלח עם cryo-EM, הכנת דגימת cryo הפכה לאוטומטית על ידי הקפאת הציוד השולט בתנאי הכתם, הלחות והטמפרטורה. תמיסת הדגימה מועמסת על רשת TEM עם ממברנת פחמן חורית, מוכתמת ברצף כדי להסיר את התמיסה העודפת, ולאחר מכן צוללת-קפואה עם אתאן נוזלי כדי לייצר קרח דק וזגוגי 1,5,6. עם ההתקדמות ב- cryo-EM והאוטומציה של הכנת דגימה7, cryo-EM שימש יותר ויותר לפתרון מבנה החלבונים, כולל חלבוני מעטפת עבור וירוסים וחלבוני תעלת יונים בקרום התא 8,9,10. המבנה של חלבוני מעטפת של חלקיקים נגיפיים פתוגניים חשוב להבנת הפתולוגיה של זיהומים נגיפיים, כמו גם לפיתוח מערכת האבחון והחיסונים, למשל SARS-CoV-211, שגרמו למגפת COVID-19. יתר על כן, טכניקות cryo-EM יושמו לאחרונה במדעי החומרים, כגון עבור הדמיה של חומרים רגישים לאלומה המשמשים בסוללה 12,13,14 ובמערכותקטליטיות 14,15 וניתוח המבנה של חומרים אנאורגניים במצב פתרון16.
למרות התפתחויות בולטות ב- cryo-EM ובטכניקות רלוונטיות, קיימות מגבלות בהכנת דגימת cryo, מה שמפריע לניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה. הכנת סרט קרח זגוגי בעובי אופטימלי חשובה במיוחד לקבלת המבנה התלת-ממדי של חומרים ביולוגיים ברזולוציה אטומית. הקרח חייב להיות דק מספיק כדי למזער את רעשי הרקע מאלקטרונים המפוזרים על ידי הקרח ולאסור על חפיפה של ביו-מולקולות לאורך נתיב קרן האלקטרונים 1,17. עם זאת, אם הקרח דק מדי, הוא עלול לגרום למולקולות חלבון להתיישר בכיוונים מועדפים או לנטרל 18,19,20. לכן, עובי הקרח הזגוגי צריך להיות מותאם בהתאם לגודל החומר המעניין. יתר על כן, בדרך כלל נדרש מאמץ נרחב להכנת דגימה ולסינון ידני של שלמות הקרח והחלבון ברשתות ה-TEM המוכנות. תהליך זה גוזל זמן רב, מה שמעכב את יעילותו לניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה. לכן, שיפורים באמינות ובשכפול של הכנת דגימות cryo-EM ישפרו את השימוש ב- cryo-EM בביולוגיה מבנית ובגילוי תרופות מסחריות, כמו גם במדע החומרים.
כאן, אנו מציגים תהליכי מיקרו-פבריקציה ליצירת שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות תחמוצת גרפן (GO) המיועדים לקריו-EM בתפוקה גבוהה עם עובי קרח מבוקר21. השבב בעל התבנית הזעירה יוצר באמצעות טכניקות של מערכת מיקרו-אלקטרומכנית (MEMS), שיכולה לתמרן את המבנה והממדים של השבב בהתאם למטרות ההדמיה. לשבב המיקרו-תבניתי עם חלונות GO יש מבנה מיקרווול שניתן למלא בתמיסת הדגימה, וניתן לווסת את עומק המיקרווול כדי לשלוט בעובי הקרח הזגוגי. הזיקה החזקה של GO לביומולקולות מגבירה את ריכוז הביומולקולות להדמיה, ומשפרת את היעילות של ניתוח המבנה. יתר על כן, השבב בעל התבנית הזעירה מורכב ממסגרת Si, המספקת יציבות מכנית גבוהה עבור הרשת19, מה שהופך אותה לאידיאלית לטיפול בשבב במהלך הליכי הכנת דגימה והדמיית cryo-EM. לכן, שבב מיקרו-תבניתי עם חלונות GO המיוצרים על ידי טכניקות MEMS מספק אמינות ושכפול של הכנת דגימת cryo-EM, אשר יכול לאפשר ניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה המבוסס על cryo-EM.
Protocol
Representative Results
Discussion
תהליכי המיקרו-פבריקציה לייצור שבבים עם מיקרו-תבניות עם חלונות GO מוצגים כאן. השבב המיקרו-תבניתי המפוברק נועד לווסת את עובי שכבת הקרח הזגוגית על ידי שליטה בעומק המיקרו-חור באמצעות חלונות GO בהתאם לגודל החומר שיש לנתח. שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות GO יוצר באמצעות סדרה של טכניקות MEMS ושיטת העברת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-H.K., S.K., M.L., ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של המכון למדע בסיסי (מענק מס’ IBS-R006-D1). S.K., M.L., ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של תוכנית החוקרים החלוצים היצירתיים דרך האוניברסיטה הלאומית של סיאול (2021) ומענק ה- NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; גרנט מס’ NRF-2020R1A2C2101871, ו- NRF-2021M3A9I4022936). M.L. ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של מלגת POSCO Science של קרן POSCO TJ Park ומענק NRF הממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס’ NRF-2017R1A5A1015365). J.P. מכיר בתמיכה הכספית ממענק ה-NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס’ NRF-2020R1A6C101A183), ותוכניות יוזמות המחקר הבין-תחומיות של המכללה להנדסה והמכללה לרפואה, האוניברסיטה הלאומית של סיאול (2021). M.-H.K. מכיר בתמיכה הכספית ממענק ה-NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס’ NRF-2020R1I1A1A0107416612). המחברים מודים לצוות ולצוות של המרכז האוניברסיטאי הלאומי בסיאול להדמיית מקרומולקולרית ותא (SNU CMCI) על מאמציהם הבלתי נלאים וההתמדה שלהם בניסויי cryo-EM. המחברים מודים לס.ג’יי קים מהמרכז הלאומי למתקני מחקר בין-אוניברסיטאיים על הסיוע בניסויי FIB-SEM.
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
References
- Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
- Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
- Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
- Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
- Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
- Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
- Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
- Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
- Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
- Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
- Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
- Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
- Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
- Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
- Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
- Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
- Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
- Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
- Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
- Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).
