Fabricación de chip micropatrón con espesor controlado para microscopía electrónica criogénica de alto rendimiento

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) se ha desarrollado para resolver la estructura tridimensional (3D) de las proteínas en su estado nativo 1,2,3,4. La técnica consiste en fijar proteínas en una capa delgada (10-100 nm) de hielo vítreo y adquirir imágenes de proyección de proteínas orientadas aleatoriamente utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM), con la muestra mantenida a temperatura de nitrógeno líquido. Miles o millones de imágenes de proyección son adquiridas y utilizadas para reconstruir una estructura 3D de la proteína mediante algoritmos computacionales ^5,6. Para un análisis exitoso con crio-EM, la preparación de crio-muestras se ha automatizado mediante la congelación por inmersión del equipo que controla las condiciones de borrado, la humedad y la temperatura. La solución de muestra se carga en una rejilla TEM con una membrana de carbono agujereada, se borra sucesivamente para eliminar el exceso de solución y luego se congela con etano líquido para producir hielo vítreo delgado ^1,5,6. Con los avances en crio-EM y la automatización de la preparación de^{muestras 7}, el crio-EM se ha utilizado cada vez más para resolver la estructura de las proteínas, incluidas las proteínas de la envoltura para virus y las proteínas del canal iónico en la membrana celular ^8,9,10. La estructura de las proteínas de la envoltura de las partículas virales patógenas es importante para comprender la patología de la infección viral, así como para desarrollar el sistema de diagnóstico y las vacunas, por ejemplo, el SARS-CoV-2¹¹, que causó la pandemia de COVID-19. Además, las técnicas de crio-EM se han aplicado recientemente a las ciencias de los materiales, como para materiales sensibles al haz de imágenes utilizados en la batería ^12,13,14 y los sistemas catalíticos ^14,15 y el análisis de la estructura de materiales inorgánicos en estado de solución¹⁶.

A pesar de los notables desarrollos en crio-EM y técnicas relevantes, existen limitaciones en la preparación de criomuestras, lo que dificulta el análisis de estructuras 3D de alto rendimiento. Preparar una película de hielo vítreo con un espesor óptimo es especialmente importante para obtener la estructura 3D de materiales biológicos con resolución atómica. El hielo debe ser lo suficientemente delgado como para minimizar el ruido de fondo de los electrones dispersos por el hielo y para prohibir la superposición de biomoléculas a lo largo de la trayectoria del haz de electrones ^1,17. Sin embargo, si el hielo es demasiado delgado, puede hacer que las moléculas de proteínas se alineen en las orientaciones preferidas o desnaturalicen 18,19,20. Por lo tanto, el espesor del hielo vítreo debe optimizarse en función del tamaño del material de interés. Además, generalmente se necesita un esfuerzo extenso para la preparación de la muestra y la detección manual de la integridad del hielo y la proteína en las rejillas TEM preparadas. Este proceso consume mucho tiempo, lo que dificulta su eficiencia para el análisis de estructuras 3D de alto rendimiento. Por lo tanto, las mejoras en la fiabilidad y reproducibilidad de la preparación de muestras de crio-EM mejorarían la utilización de crio-EM en biología estructural y descubrimiento de fármacos comerciales, así como para la ciencia de materiales.

Aquí, presentamos procesos de microfabricación para hacer un chip micro-estampado con ventanas de óxido de grafeno (GO) diseñadas para crio-EM de alto rendimiento con espesor de hielo controlado²¹. El chip micropatronado se fabricó utilizando técnicas de sistema microelectromecánico (MEMS), que pueden manipular la estructura y las dimensiones del chip según los fines de imagen. El chip micropatronado con ventanas GO tiene una estructura de micropocillo que se puede llenar con la solución de muestra, y la profundidad del micropozo se puede regular para controlar el grosor del hielo vítreo. La fuerte afinidad de GO por las biomoléculas mejora la concentración de biomoléculas para la visualización, mejorando la eficiencia del análisis de la estructura. Además, el chip micropatronado está compuesto por un marco de Si, que proporciona una alta estabilidad mecánica para la rejilla¹⁹, lo que lo hace ideal para manipular el chip durante los procedimientos de preparación de muestras y la obtención de imágenes crio-EM. Por lo tanto, un chip micropatrullado con ventanas GO fabricadas por técnicas MEMS proporciona confiabilidad y reproducibilidad de la preparación de muestras crio-EM, lo que puede permitir un análisis de estructura eficiente y de alto rendimiento basado en cryo-EM.