JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Eski Vivo Kemirgenlerde Trigeminovasküler Sistemden Kalsitonin Geni ile İlgili Peptitin Salınımı

Published: May 16, 2022
doi:
10.3791/63723
, , ,
1Danish Headache Center, Department of Neurology,Rigshospitalet, University of Copenhagen, 2EHESP, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail),Univ Rennes, Inserm, 3Department of Biology, Section of Cell Biology and Physiology,University of Copenhagen

Summary

Bu protokol, ex vivo kalsitonin genine bağlı peptid (CGRP) salınım modelini ve farmakolojik ajanların kemirgenlerde trigeminovasküler sistemden salınan CGRP miktarı üzerindeki etkisini ölçme stratejisini açıklamaktadır.

Abstract

Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP) ilk olarak 1980’lerde kalsitonin geninden bir ek varyant olarak keşfedilmiştir. Keşfinden bu yana, migren patofizyolojisindeki rolü, önce güçlü vazodilatör özellikleri ve daha sonra duyusal trigeminovasküler sistemde bir nörotransmitter olarak varlığı ve işlevi ile iyi bir şekilde kurulmuştur. CGRP’nin migrene neden olma yeteneği, ilaç endüstrisine CGRP’nin etkisini inhibe eden monoklonal antikorlar ve antagonistler geliştirmeleri için destek sağlamıştır. Yeni bir tedavi paradigmasının migrenin profilaktik tedavisinde etkili olduğu kanıtlanmıştır. Migren mekanizmalarını daha iyi anlamak için yararlı araçlardan biri, trigeminovasküler sistemden CGRP salınımının ex vivo modelidir. Yeni etkili migren tedavilerini daha da geliştirmek için know-how elde etmek için çeşitli farmakolojik araçlarla kullanılabilecek nispeten basit bir yöntemdir. Bu protokol, bir CGRP salınım modelini ve farmakolojik ajanların kemirgenlerde trigeminovasküler sistemden salınan CGRP miktarı üzerindeki etkisini ölçme tekniğini açıklamaktadır. Ötanaziden protein düzeylerinin ölçümüne deneysel yaklaşımı açıklayan bir prosedür sunulmaktadır. Trigeminal ganglionun ve trigeminal nucleus caudalis’in hem farelerden hem de sıçanlardan temel izolasyonu ve sıçan dura materinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Ayrıca, her iki türden (sıçanlar ve fareler) temsili sonuçlar sunulmaktadır. Bu teknik, migren patofizyolojisinde rol oynayan moleküler mekanizmaları çeşitli farmakolojik bileşikler ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar kullanarak araştırmak için anahtar bir araçtır.

Introduction

Migren, DSÖ’ye göre, 1 milyardan fazla insanı etkilediği tahmin edilen ve dünya çapında engelliliğin önde gelen nedenlerinden biri olan nörolojik bir hastalıktır1. Bu nedenle migrenin hem hastalar hem de toplum üzerinde önemli bir etkisi vardır. CGRP antagonize edici ilaçların son klinik başarısına rağmen, hastaların büyük bir kısmı gelişmiş tedavi seçeneklerine ihtiyaç duymaktadır 2,3,4,5. Yeni etkili tedavilere yol açan migren patofizyolojisinin aydınlatılması gerekmektedir. Meninksler, trigeminal ganglionlar (TG) ve trigeminal nucleus caudalis (TNC)’den oluşan trigeminovasküler sistem içinde sinyalizasyon migren patofizyolojisi için santraldir 6,7.

37 amino asit nöropeptit kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP) ilk olarak 1980’lerin başında, Amara ve meslektaşlarının kalsitonin 8,9’a ek olarak CGRP için mRNA kodlaması vermek üzere kalsitonin geninin birincil RNA-transkriptinin işlenebileceğini gösterdiğinde keşfedildi. Sonraki araştırmalar migren patofizyolojisi10 ile bir bağlantı olduğunu öne sürdü. CGRP, güçlü vazodilatasyon özelliklerine sahip bir nörotransmitterdir 11,12,13,14,15,16,1 7 ve merkezi ve periferik sinir sisteminde yaygın olarak dağılır 13,14,18,19,20,21,22 . CGRP’nin migrene katılımı, insanlarda migren atakları sırasında ekstraserebral dolaşımda artmış CGRP seviyelerinin keşfi ile vurgulanmıştır23 ve CGRP infüzyonunun hastalarda migren benzeri ağrıya neden olduğu24. İki yıl sonra, CGRP antagonisti olcegepant’ın migren tedavisinde etkililiğine dair ilk kavram kanıtı çalışması yayınlandı25.

CGRP, TG 21,26’da gösterildiği gibi trigeminovasküler sistemde, dura mater27,28,29 ve TNC 30’u innerve eden duyusal sinir liflerinde bol miktarda bulunur. Trigeminovasküler sistemde, CGRP, TG’nin küçük-orta büyüklükteki nöronlarında, miyelinlenmemiş C-liflerinde bulunur ve TG’nin nöronal popülasyonunun yaklaşık% 50’sinde eksprese edilir. CGRP reseptörü esas olarak daha büyük nöronlarda eksprese edilir ve miyelinli Aδ-liflerindebulunur 31,32. CGRP, kimyasal veya elektriksel stimülasyon üzerine nöronlardan salınır33,34. CGRP salınımına yol açan yolakların incelenmesi ve bu aktivasyonun yeri migren patofizyolojisini anlamak için çok önemlidir. Son 5 on yıl boyunca, klinik öncesi çalışmalar migrenle ilişkili sinyalizasyon hakkında kapsamlı bilgi edinilmesine katkıda bulunmuş ve yeni tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur35. Migren araştırmalarında vasküler ve nörojenik tutulumu göz önünde bulunduran birçok yöntem modifiye edilmiş ve uygulanmıştır. Biyolojik bileşiklere veya farmakolojik tedavilere arteriyel yanıtların in vivo ve in vitro modellerinden17,36,37 ve elektriksel sinir stimülasyonu 38,39’dan bahsedilebilir. Ayrıca, TNC’deki aktive nöronlar c-Fos ekspresyonu40,41,42 ve bu bölgedeki elektrofizyolojik kayıtlar 43,44 ile tespit edilebilir. Her iki yöntem de beyine kafadan iletilen nosiseptif sinyalleri ölçer, örneğin dura mater. Sadece bir preklinik modelin kullanılması, migren patofizyolojisinin tam resmini sunmamaktadır. Bu nedenle, migren patofizyolojisinin mümkün olduğunca çok yönünü kapsayan farklı modelleri birleştirmek önemlidir. Yeni modellerin sürekli geliştirilmesi, migren mekanizmalarının çeşitli yönlerini kapsayacak ve zamanla migren patofizyolojisinin gizemi ortaya çıkacaktır.

Burada, kimyasal stimülasyondan sonra farelerden izole TG ve TNC’de ex vivo olarak gerçekleştirilen CGRP salınım yönteminin ayrıntılı bir protokolü sunulmaktadır. CGRP salınımı ayrıca sıçanlardan dura materde de incelenebilir. Böylece, sıçanlar için deneysel protokolde, dura mater TG ve TNC ile birlikte tanımlanmıştır. CGRP salınım yönteminin temeli ilk olarak 1999 yılında, Ebersberger ve meslektaşlarının öncü araştırmalar yürüttüğü ve CGRP’nin sıçanlarda dural afferentlerin kimyasal ve elektriksel uyarılmasından sonra dura materden salındığını bulduğu45 yılında tanımlanmıştır. Daha sonra, bu yaklaşım TG46 ve TNC47’den CGRP sürümüne genişletildi. Daha sonra, yöntem farelerde TG ve TNC’ye uygulanacak şekilde değiştirildi. Şimdiye kadar, dura mater’den CGRP salınımı farelerde zor olmuştur.

Protocol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürleri, Avrupa Topluluğu’nun hayvanların bakımı ve kullanımı kılavuzuna (2010/63/UE) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü göstermek için 10 haftalık erkek C57BL / 6JBomTac fareleri ve 10 haftalık erkek Sprague Dawley fareleri kullanıldı. 1. Sentetik interstisyel sıvının hazırlanması Aşağıdaki tarife göre sentetik geçiş sıvısı (SIF) hazırlayın: 108 mM NaCl, 3.48 mM KCl, 3.50 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO3, 11.70 mM NaH 2 PO4, 1.50 mM CaCl2, 9.60 mM Na-glukonat, 5.50 mM glikoz ve 7.60 mM sakkaroz (bkz.NOT: SIF, stimülasyon hedefine bağlı olarak değişebilir, örneğin, kalsiyum kanallarını incelerken kalsiyum içermeyen bir çözelti kullanılabilir. PH’ı 7,4’e ayarlayın ve karbojen gazıyla pH’ı stabilize edin (%5 CO 2 ve O2)46. 2. Ötenazi Yetişkin fareleri ve sıçanları% 70 CO 2 ve% 30O2 karışımı ile anestezialtına alın. Bir çift makas kullanarak farelerin ve bir giyotin kullanarak sıçanların kafasını kesin (bkz.NOT: Araştırmanın amacına uygun bir gerilme ve yaş kullanın. Bu modelde hem erkekler hem de dişiler kullanılabilir. Başını, omuriliğin C3-C4 seviyesinde vücuttan ayırın.NOT: Ötenazi, intraperitoneal pentobarbital enjeksiyonu (100-150 mg / kg) ile de yapılabilir. 3. Diseksiyon Aşağıdaki adımları izleyerek sıçan dokusunu hazırlayın.Baş ve boyun çevresindeki deri ve kası bir çift makas kullanarak çıkarın (Şekil 1A). Alt çeneleri kafadan ayırmak için bir kemik düzeltici ve makas kullanın (Şekil 1B-C). Omurların dorsal kısmına kaudal olarak bir kemik düzeltici yerleştirerek omuriliği açın ve omuriliği ve beyin sapını ortaya çıkarmak için omurların dorsal kısmını çıkarın (Şekil 1D). Beyinciği açığa çıkaran bu kemik yapılarını çıkarmak için kafatasının kaudal kısmını oksipital ve interparietal kemiklerin sınırlarından kesin (Şekil 1E).NOT: Omurları keserken ve çıkarırken beyin sapına ve omuriliğe zarar vermemek önemlidir. Beyin sapının dorsolateral kısmını yaylı makasla keserek her iki taraftaki bregmadan yaklaşık 13-16 mm kaudal olarak çalışan TNC’yi (Sp5C) izole edin. Sol ve sağ taraftaki TNC’yi SIF’ye daldırın (Şekil 1E-I).NOT: Açıklama yetişkin sıçanlara karşılık gelir. Bir testere kullanarak kafatasını ikiye bölmek için kafayı orta sagital olarak kesin (Şekil 1J-L). Bir spatula kullanarak kafatasına bağlı dura materine dokunmadan ve trigeminal siniri beyin sapına girdiği yerde kesmeden beyni dikkatlice çıkarın (Şekil 1M-P). TG’yi izole etmek için, görsel sınırların etrafındaki dalları da dahil olmak üzere kesin. Foramen ovale girdiği mandibuler dalı kesin. Kafatasına giren oftalmik ve maksiller dalları makroskopik olarak bölünmedikleri için kesin. TG’yi parçalara ayırırken, TG’yi kaplayan dura materini çıkarın (Şekil 1Q-T). Kafatası yarılarını ve TG’leri SIF’ye batırın. Aşağıdaki adımları izleyerek fare dokusunu hazırlayın.Küçük makas kullanarak baş ve boyun çevresindeki deri ve kasları çıkarın (Şekil 2A-B). Omurların dorsal kısmına kaudal olarak bir çift küçük makas sokarak omuriliği açın ve omuriliği ve beyin sapını ortaya çıkarmak için omurların dorsal kısmını çıkarın (Şekil 2C).NOT: Omurları keserken ve çıkarırken omuriliğe zarar vermemek önemlidir. Beyinciği açığa çıkaran bu kemik yapılarını çıkarmak için kafatasını oksipital ve interparietal kemiklerin sınırlarından kesin (Şekil 2D-F). Daha sonra, parietal kemiği orta sagital olarak kesin ve serebrum açığa çıkarmak için kemiği çıkarın (Şekil 2G-I). Beyin sapını ortaya çıkarmak için beyinciği bir spatula ile dikkatlice çıkarın (Şekil 2J). Beyin sapının TNC içeren kısmını yaylı makas kullanarak izole edin (Şekil 2K-N). Beyin sapını TNC ile SIF’ye batırın (Şekil 2O). Beyni çıkarın ve trigeminal siniri beyin sapına girdiği yerde kesin (Şekil 2P-Q). TG’yi izole etmek için, görsel sınırların etrafındaki dalları da dahil olmak üzere kesin. Foramen ovale girdiği mandibuler dalı kesin. Kafatasına giren oftalmik ve maksiller dalları makroskopik olarak bölünmedikleri için kesin. TG’yi diseke ederken, TG’yi kaplayan dura materini çıkarın (Şekil 2R-S). TG’leri SIF’ye daldırın (Şekil 2T). 4. Yıkama Kafatası yarılarını, TNC’leri ve TG’leri SIF’de 30 dakika boyunca yıkayın ve SIF’yi oda sıcaklığında her 5 dakikada bir değiştirin.NOT: Yıkama adımları, kolay SIF değişimi sağlamak için doku tül kapaklı plastik kaplarda tutulurken gerçekleştirilebilir (Şekil 3A-B). Aşağıdaki adımları izleyerek sıçan dokusunu hazırlayın.TNC yarılarını, 350 μL SIF ile mikrosantrifüj tüp kapaklarını ayırmak için aktarın (Şekil 3C). TG’leri mikrosantrifüj tüp kapaklarına aktarın – 350 μL SIF ile mikrosantrifüj tüp kapağı başına bir TG (Şekil 3C). Kafatası yarısını kilden veya 6 kuyucuklu bir kültür plakasından yapılmış platformlara yerleştirin ve kafatasını 400 μL SIF ile doldurun (Şekil 3C). Aşağıdaki adımları izleyerek fare dokusunu hazırlayın.TNC ile beyin sapını 250 μL SIF içeren bir mikrosantrifüj tüp kapağına aktarın (Şekil 3D). İki TG’yi 250 μL SIF içeren bir mikrosantrifüj tüp kapağına aktarın (Şekil 3D).NOT: Farelerden doku kullanırken mikrosantrifüj tüp kapağı başına iki TG yerleştirin. Sıçan kafataslarını ve sıçan ve fare dokusuna sahip mikrosantrifüj tüp kapaklarını 37 ° C’de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. SIF’i 20 dakika boyunca her 5 dakikada bir pipet kullanarak değiştirin.NOT: SIF eklenirken ve çıkarılırken dokuya dokunmamak önemlidir. 5. Uyuşturucu testi Bazal CGRP salınım seviyelerini belirleyin.Son yıkamayı takiben, fare TG ve TNC’ye 250 μL SIF ekleyin. Sıçan TG ve TNC’ye 350 μL ve her sıçan kafatasına 400 μL ekleyin. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, bir mikrosantrifüj tüpünde numunenin 200 μL’sini toplayın ve bazal CGRP salınımının ölçülmesine izin vermek için 50 μL 10x EIA tamponu ekleyin (CGRP enzim immünoassay kiti ile birlikte verilir, Malzeme Tablosuna bakınız) (adım 6). Kalan sıvıyı atın.NOT: Kuluçka süresi tüm numuneler için aynı olmalıdır. Hemen numuneleri -20 °C’de saklayın. Bazal CGRP salınım seviyelerinin örneklenmesinden sonra, üç yöntemden birini izleyin: (A) Tek stimülasyon (adım 5.2); (B) Konsantrasyon-yanıt stimülasyonu (adım 5.3); ve (C) Stimülasyonun inhibisyonu (adım 5.4) (Şekil 4).NOT: Kullanılan test bileşiği ve konsantrasyonları çalışmanın amacına bağlıdır. Aşağıdaki adımları izleyerek tek stimülasyon gerçekleştirin.Dokuya test bileşiği veya aracı ekleyin ve 10 dakika bekletin (hacim: fare TG ve TNC için 250 μL, sıçan TG ve TNC için 350 μL ve her sıçan kafatası için 400 μL). 10 dakikalık inkübasyondan sonra, numunenin 200 μL’sini 50 μL 10x EIA tamponuna sahip bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Kalan sıvıyı atın ve numuneleri hemen -20 ° C’de saklayın.NOT: Kuluçka süresi tüm numuneler için aynı olmalıdır. Aşağıdaki adımları izleyerek konsantrasyon-yanıt stimülasyonu gerçekleştirin.Test bileşiğini veya aracı istenen konsantrasyonlarda seyreltin. Test bileşiğini, en düşük konsantrasyondan başlayarak artan konsantrasyonlarda ekleyin.NOT: Kullanılan test bileşiği ve konsantrasyonları çalışmanın amacına bağlıdır. Örneğin, bu çalışma için 1 μM, 10 μM ve 100 μM süpersinnamaldehit kullanılmıştır. Test bileşiğinin en düşük konsantrasyonunu (bu çalışma için 1 μM) ve karşılık gelen aracı iki özdeş doku preparatına ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin (hacim: fare dokusu için 250 μL, sıçan TG ve TNC için 350 μL ve her sıçan kafatası için 400 μL). 10 dakikalık inkübasyondan sonra, numunenin 200 μL’sini 50 μL 10x EIA tamponuna sahip bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Kalan sıvıyı atın ve dokuya ikinci en düşük konsantrasyonu (bu çalışma için 10 μM) ekleyin. Hemen numuneleri -20 °C’de saklayın. Bu prosedürü kalan konsantrasyonlarla tekrarlayın (bu çalışma için 100 μM). Aşağıdaki adımları izleyerek stimülasyonun inhibisyonunu gerçekleştirin.Blokeri veya aracı dokuya ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin (hacim: fare dokusu için 250 μL, sıçan TG ve TNC için 350 μL ve her sıçan kafatası için 400 μL).NOT: Kullanılan bloker ve konsantrasyon çalışmanın amacına bağlıdır. Örneğin, Şekil 5’teki temsili sonuç için 3 μM glibenklamid kullanılmıştır. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, 50 μL 10x EIA tamponuna sahip bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL’lik bir numune toplayın. Kalan sıvıyı atın ve numuneleri hemen -20 ° C’de saklayın. Agonisti veya agonist + blokeri dokuya ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve 10 dakika boyunca inkübe edin.NOT: Kullanılan agonist, bloker ve konsantrasyonlar çalışmanın amacına bağlıdır. Bu çalışmada 3 μM glibenklamid ve 1 μM kapsaisin kullanılmıştır, Şekil 5. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, 50 μL 10x EIA tamponuna sahip bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL’lik bir numune toplayın. Kalan sıvıyı atın ve numuneleri hemen -20 ° C’de saklayın. Deneme için pozitif bir kontrol gerçekleştirin.Uygun olduğunda, protokolün sonundaki dokuya pozitif bir kontrol (örneğin, 1-10 μM kapsaisin, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve 10 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra 50 μL 10x EIA tamponu olan bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL’lik bir örnek toplayın.NOT: Kurulumun ve dokuların çalıştığından emin olmak için pozitif bir kontrol eklemek avantajlıdır. Kapsaisin 48,49,50 veya depolarizan potasyum uyaranı (40-60 mM KCl)46,47,49, CGRP’nin trigeminovasküler sistemden salınmasına neden olmak için rutin olarak kullanılır. 40-60 mM KCl SIF, SIF olarak hazırlanır, ancak NaCl, eşmolar bazda KCl ile değiştirilir. 6. CGRP konsantrasyonlarının analizi Üreticinin protokolünü takip eden bir enzim immünoassay (EIA) kiti kullanarak salınan CGRP miktarını ölçün (bkz. Bir plaka fotometresi kullanarak optik yoğunluğu 410 nm’de ölçün. Farklı bir CGRP EIA kiti kullanılıyorsa, optik yoğunluğu üreticinin protokolünde sağlanan dalga boyunda ölçün.NOT: Numuneler standart eğriye uyacak şekilde seyreltilmelidir. Veri analizi gerçekleştirin.Verileri mutlak konsantrasyonlar olarak sunun veya spesifik dokudan bazal CGRP salınımına normalleştirin.

Representative Results

Bu teknik, migrende rol oynayan CGRP ile ilişkili moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılan bir araçtır. Trigeminovasküler sistemin farklı seviyelerinden CGRP salınımını değerlendirme avantajına sahiptir ve çeşitli farmakolojik bileşiklerle kombinasyon halinde hem vahşi tip hem de transgenik farelere ve sıçanlara uygulanabilir. Burada, sıçanlardan konsantrasyon-yanıt ve blokaj deneyleri ve vahşi tip ve transgenik farelerden konsantrasyon-yanıt sonuçları sunulmaktadır. CGRP salınım yöntemi, dişi spontan trigeminal allodinik (STA) sıçanlarda KATP kanal inhibitörü glibenklamidin TG ve dura mater’den CGRP salınımı üzerindeki etkisini incelemek için kullanıldı. İlk olarak, optimum kapsaisin konsantrasyonu, bir konsantrasyon-yanıt çalışması tasarımı kullanılarak bulundu. Kapsaisin maruziyeti, dura mater ve TG’den araca kıyasla önemli bir CGRP salınımına neden oldu (Şekil 5). Dura materinde, CGRP’nin maksimum salınımı 1 μM kapsaisin’de bulundu ve TG’de maksimum CGRP salınımı 10 μM kapsaisin’de bulundu (Şekil 5A-B). Konsantrasyon-yanıt deneylerine dayanarak, deneyleri bloke etmek için 1 μM kapsaisin ve 3 μM glibenklamid kullanılmıştır. Glibenklamid, tek yönlü ANOVA51 ile analiz edildiğinde dura mater (P = 0.441) ve TG’den (P = 0.881) bazal CGRP salınımı üzerinde hiçbir etki göstermedi. Glibenklamid, tek yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde araçla kapsaisin ile karşılaştırıldığında, dura mater’de kapsaisin kaynaklı CGRP salınımını% 40 (P = 0.031) ve TG’de% 39 (P = 0.003) oranında önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 5C-D)51. Farelerde, protokol, GTN’nin neden olduğu aşırı duyarlılığın TRPA1 kanallarına tamamen bağımlı olduğu bir GTN fare migren modelinde geçici reseptör potansiyel ankirin 1 (TRPA1) iyon kanalının katılımını incelemek için kullanıldı. TRPA1 agonisti süpersinnamaldehitin (SCA), CGRP’yi TG’den 1 μM, 10 μM ve 100 μM SCA ile doza bağımlı bir şekilde serbest bıraktığı ve iki yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde sırasıyla% 9 (P = 0.23),% 51 (P = 0.011) ve% 69 (P = 0.0097) artmış CGRP salınımına neden olduğu bulunmuştur. Bu salınım, 1 μM, 10 μM ve 100 μM SCA’ya maruz kalmanın, iki yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde, CGRP salınımında sırasıyla% 11 (P > 0.99), -% 13 (P > 0.99) ve% 9 (P = 0.97) yüzde değişime neden olduğu Trpa1 null farelerden TG’de yoktu. 10 μM kapsaisin (pozitif kontrol) ile sonraki stimülasyon, tüm doku örneklerinin CGRP’yi serbest bırakabileceğini göstermektedir (Şekil 6)50. Şekil 1: Sıçanlardan doku diseksiyonu adım adım yapılır. (A-T) ayrıntıları protokol bölümünde verilmiştir (adım 3.1). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Farelerden doku adım adım diseksiyonu. (A-T) ayrıntıları protokol bölümünde verilmiştir (adım 3.2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Kemirgen dokusunun yıkanması ve kuluçkalanması. (A-B) SIF ile plastik kaplarda taze izole edilmiş doku. Kaplar, SIF’in kolayca değiştirilmesini sağlamak için tül ile kaplanmıştır. (C) Sıçan dokusu – 6 kuyucuklu bir kültür plakasına yerleştirilmiş kafatasının iç astarlarını kaplayan dura mater ile iki kafatası yarısı. Sağ ve sol trigeminal çekirdek kaudalis ayrı mikrosantrifüj tüp kapaklarında (kapakların üst sırası). Bireysel mikrosantrifüj tüp kapaklarındaki iki trigeminal gangliyon (kapakların alt sırası). (D) Fare dokusu – Ayrı bir mikrosantrifüj tüp kapağında (üstte) beyin sapının trigeminal çekirdek kaudalis içeren kısmı. İki fare trigeminal gangliyonu bir mikrosantrifüj tüp kapağında (altta) bulunur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: CGRP sürümü için tasarımları inceleyin. CGRP sürüm deneylerini gerçekleştirmek için üç farklı protokol. İlaçlar sentetik interstisyel sıvı (SIF) içinde seyreltilmelidir. (A) Tek stimülasyon. (B) Konsantrasyon-yanıt stimülasyonu. (C) Bir stimülasyonun inhibisyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Glibenklamid, sıçan dura mater ve trigeminal gangliondan kapsaisin kaynaklı CGRP salınımını inhibe eder. Aslen Thomas Jefferson Üniversitesi52’den elde edilen dişi spontan trigeminal allodinik (STA) sıçanlardan (215-318 g) izole edilen trigeminal ganglion ve dura mater’den CGRP seviyeleri, ticari insan CGRP EIA kitleri ile ölçülmüştür. (A-B) Kapsaisin konsantrasyonlarını (10 nM, 100 nM, 1 μM ve 10 μM) arttırdıktan sonra (A) dura mater ve (B) trigeminal gangliondan CGRP salınımı (n = 4). Veriler tek tek noktalar halinde sunulmuş ve iki yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. p < 0.0001 (C-D) Araç, 3 μM glibenklamid (glib), 1 μM kapsaisin ve 1 μM kapsaisin + 3 μM glib (n = 6-11) maruz kaldıktan sonra (C) dura mater ve (D) trigeminal gangliondan salınan CGRP seviyeleri. Veriler tek tek noktalar ve ortalama değerler olarak sunulmuş ve tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. *araçla karşılaştırıldığında. #capsaicin ile karşılaştırıldığında capsaicin + glib. #P 0,05, ** ve ##P 0,01 <, ****P 0,0001 < <. Analizler Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi ile takip edildi. Tüm testler için anlamlı düzeyde α = 0.05 kullanılmıştır. Bu rakam Christensen ve ark. 51. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: SCA’ya maruz kalma, fare trigeminal ganglionundan TRPA1’e bağımlı CGRP salınımına neden olur. WT ve Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 erkek fareden (8-10 hafta) izole edilen trigeminal gangliondan salınan CGRP düzeyleri, pozitif kontrol olarak 1 μM, 10 μM ve 100 μM’de süpersinnamaldehit (SCA) ve 10 μM’de kapsaisin maruziyetinden sonra sıçan CGRP EIA kitleri ile ölçüldü (n = 6). Her fareden gelen veriler ayrı noktalar olarak sunulur ve çubuklar ortalama değerleri gösterir. İstatistikler: Her konsantrasyonda SCA ve araç ile bazal ve pozitif kontrol arasında karşılaştırma iki yönlü tekrarlanan ANOVA ile yapıldı. Önemli bir α seviyesi = 0.05. *P < 0,05, **P 0,01′<. Bu rakam Christensen ve ark. 50. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Tarif edilen yöntem migren patofizyolojisinde CGRP’nin önemini gösteren çalışmalar sonrasında geliştirilmiştir. CGRP’nin trigeminovasküler sistemden salınmasında rol oynayan mekanizmaları araştırmak için çok uygundur, bu da baş bölgesinde ağrı sinyalizasyonu için çok önemlidir. Bu modelde elde edilen CGRP miktarı, dura mater, TG ve TNC’yi innerve eden trigeminal sinirlerden CGRP salınımını doğrudan ölçer. CGRP salınım miktarı, insanlarda termokoagülasyondan sonra, kedi39,55,56’da trigeminal stimülasyondan sonra plazmada ölçülen salınımdan 45,54 ve migren atakları sırasında 23’ten kantitatif olarak daha büyüktür. Bir açıklama, CGRP’nin kanda seyreltildiği ve parçalandığıolabilir 54. Bununla birlikte, kimyasallarla doğrudan stimülasyonun patofizyolojik aktivasyondan daha üstün olabileceği unutulmamalıdır. Diğer avantajları, salınımın trigeminovasküler sistem içindeki üç farklı bölgeden bulunmasının mümkün olması ve farmakolojik manipülasyonla birlikte ve genetiği değiştirilmiş kemirgenlerden gelen dokularda kullanılabilmesidir.

Son zamanlarda, birçok klinik öncesi kemirgen modeli, maddelerin sistemik olarak uygulanmasına ve ardından von Frey testi57,58, grimacing 59,60,61 veya hafif isteksizlik 62,63,64 kullanılarak ağrı veya migrenle ilgili okumalara odaklanmaktadır. Bu yöntemler, farklı maddelerin ağrıya neden olan ve ağrı giderici özelliklerini anlamada yararlıdır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar ilgili spesifik hedef dokular hakkında bilgi vermez. Mevcut yöntemde, trigeminovasküler sistem üç yapıya ayrılmıştır: dura mater, TG ve TNC. Bu, her yapının yerel olarak maruz kalmasını ve belirli bir maddenin etki yerinin değerlendirilmesini sağlar. Bu, sıçanlarda voltaj kapılı kalsiyum kanallarının rolünün araştırıldığı 2011 tarihli bir çalışmada kullanılmış ve bu kanalların inhibisyonunun trigeminovasküler yol47’nin üç yapısında farklı olduğu bulunmuştur. Sinir sisteminin yapılarını parçalara ayırırken, aksotomi kaçınılmazdır. Aksotominin çeşitli genlerin transkripsiyonunu değiştirdiği gösterilmiştir65. Bu transkripsiyonel değişiklikler bu yöntemden elde edilen sonuçları etkilemek için çok yavaştır, ancak fosforilasyondaki değişiklikler in vivo durumlarla karşılaştırıldığında dışlanamaz46. CGRP gibi nöropeptitler hücre somasında oluşmasına rağmen, nöropeptitlerin salınımı ve etkisi genellikle merkezi veya periferik sinir terminallerindedir. Bu nedenle, terminaller de dahil olmak üzere sağlam nöronların çalışmaları, nöropeptit salınımını incelerken ilginçtir. Bu nedenle, izole ganglionlardan nöron kültürlerini inceleme yöntemleri, terminallerin bir modeli olarak hizmet etmek üzere kurulmuştur. Bununla birlikte, nöronal hücre kültürleri, mekanik ayrışma bir kültürdeki nöronları yok edebileceğinden çeşitli sorunlara maruz kalmaktadır46. Hücrelerin kültürlenmesi ile ilişkili daha uzun zaman dilimi, bu yöntemi aksotomi ve kültür koşulları nedeniyle transkriptomik değişikliklere duyarlı hale getirir65. Ayrıca, büyüme faktörlerinin eklenmesi ve yüzey kaplamalarında kültürleme, transmitter ve reseptör ekspresyonu66,67,68,69 olarak nöronal özellikleri değiştirmiştir. Bu problemler, nöronal hücre kültürleri yerine taze izole edilmiş sağlam ganglionlar üzerinde çalışırken önlenir.

Exvivo CGRP salınım yöntemiyle ilgili bir zorluk, tekrarlanabilir sonuçlar için gerekli olan dokunun hassas diseksiyonudur. TNC’nin özellikle doğru diseksiyonu zordur, çünkü bu, beyin sapı içinde görünür sınırları olmayan bir yapıdır. Ayrıca, dura mater kırılgandır ve sağlam bir yapı sağlamak için beynin çıkarılmasının dikkatli bir şekilde yapılması gerekir. Bu engeller değişen doku boyutlarına ve dolayısıyla değişen bazal ve stimülasyona bağlı CGRP seviyelerine neden olabilir. Bununla birlikte, bu varyasyon bazal CGRP salınımına normalleştirme ile açıklanabilir. TNC’yi farelerden izole ederken, beyin sapının tüm alt kısmının izole edildiği ve sıçanlarda yapıldığı gibi daha spesifik TNC içeren kısmın izole edilmediği de belirtilmelidir. Genel olarak, sıçan dokusunu kullanmak bir avantaj olabilir, çünkü bu, dura mater’den CGRP salınımının ölçülmesine ve TNC’nin daha hassas diseksiyonuna izin verir. Ayrıca, dokunun büyüklüğü aynı zamanda bir sıçanın araç kontrolü olarak kullanılmasını sağlar, çünkü bir sıçan iki kafatası yarısı, iki TG ve iki TNC ile sonuçlanır, burada dokunun bir parçası madde stimülasyonu için ve diğeri araç için kullanılır. Fareleri kullanırken, her iki TG de bir örnekte toplandığı ve TNC’ler tek bir beyin sapı olarak diseke edildiği için bir deney için iki hayvana ihtiyaç vardır. Bu nedenle, madde stimülasyonu için iki TG ve bir beyin sapı kullanılır ve araç kontrolü için iki TG ve başka bir fareden bir beyin sapı kullanılır. Bu, aynı sayıda replikasyon elde etmek için sıçanlara kıyasla iki kat daha fazla fare kullanılmasına neden olur. Kullanılan fare sayısını azaltmak için, beyin sapı dilimlerinden CGRP salınımını ölçmek için bir yöntem önerilmiştir49. Yöntemin farelerin kullanımını sağlamak için değiştirilmiş olması bir avantajdır. Bu, halihazırda mevcut olan birçok transgenik fare suşunun kullanılmasına izin verir, örneğin sinyal yollarını incelemek için yararlı bir araçtır. Deneyde kullanılan dokunun CGRP’yi serbest bırakabilmesini sağlamak için bir deneyin sonunda pozitif bir kontrol dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, hem farelerde hem de sıçanlarda 46,47,48,49,50 numaralı trigeminovasküler sistemden CGRP’yi serbest bıraktığı tespit edilen TRPV1 agonisti kapsaisin veya depolarizan uyaran potasyum (KCl) olabilir. Ayrıca, yöntem aynı zamanda migren araştırmasında büyük ilgi gören bir başka peptid olan hipofiz adenilat siklaz aktive edici peptid (PACAP) olarak diğer ilgili peptitlerin salınımını ölçmek için uyarlanmıştır70.

Yöntem, sıçanlarda ve farelerde belirli hedef dokulardan CGRP salınımını araştırmak için yararlı bir araç sağlar. Nöronların kültürlenmesiyle ilgili sorunları önleyen nispeten hızlı bir yöntemdir. Yöntem protokolü, konsantrasyon-yanıt ilişkisini incelemek veya çeşitli farmakolojik bileşikler tarafından bir yanıtın inhibisyonunu incelemek için kolayca değiştirilebilir. Exvivo CGRP salınım yöntemi, migren patofizyolojisinde CGRP’nin ve CGRP salınımı ile ilgili diğer mekanizmaların rolünü incelemek için yararlı olan birkaç klinik öncesi yöntemden biridir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Candys Vakfı tarafından finanse edildi.

Materials

6-well culture plate NUNC 140675
Calcium chloride dihydrate Merck 1.02382.1000 For SIF buffer
Caps for plastic containers ThermoFisher Scientific 536617
Capsaicin Merck M2028
CGRP kits AH Diagnostics A05482.96
CO2 Strandmøllen 4.6 For carbogen gassing of SIF
Delicate Bone Trimmer Fine Science Tools 16109-14
Glibenclamide Tocris 911
Glucose Merck G7021 For SIF buffer
Guillotine for rats Scandidact NS-802
Magnesium sulfate heptahydrate Merck M5921 For SIF buffer
Microcenrifuge tubes + lids/caps VWR 700-5239
Mini Hacksaw BAHCO 208
O2 Strandmøllen 4.5 For carbogen gassing of SIF
Pentobarbital Glostrup pharmacy NA Magistral formula
Plastic containers ThermoFisher Scientific 536455
Plate photometer – Infinite M200 Tecan NA Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan.
Software: SW Magellan v.6.3
Potassium chloride Merck P9333 For SIF buffer
Scissor Allgaier Instruments 307-156-170
Small scissor Allgaier Instruments 04-520-115
Sodium bicarbonate Merck S6014 For SIF buffer
Sodium chloride Merck S9888 For SIF buffer
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 1.06346.1000 For SIF buffer
Sodium gluconate Merck S2054 For SIF buffer
Spatula Bochem Lab Supply 3018
Spring scissor Fine Science Tools 15024-10
Sucrose Merck 84097 For SIF buffer
Supercinnamaldehyde Merck S3322
Tulle (fabrics) NA NA Bought in the local fabrics store
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
  3. Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6 (2019).
  4. Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
  5. Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
  6. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies – successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338 (2018).
  7. Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
  8. Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
  9. Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
  10. Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
  11. Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
  12. Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
  13. Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
  14. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
  15. Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
  16. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
  17. Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
  18. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  19. Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
  20. Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
  21. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
  22. Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
  23. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  24. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
  25. Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
  26. Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
  27. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  28. Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
  29. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  30. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112 (2011).
  31. Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
  32. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  33. Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
  34. Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
  35. Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
  36. Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
  37. Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
  38. Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
  39. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  40. Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
  41. Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
  42. Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, 579-588 (1999).
  43. Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
  44. Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
  45. Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
  46. Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
  47. Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
  48. Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
  49. Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
  50. Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
  51. Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
  52. Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336 (2012).
  53. Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
  54. Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
  55. Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
  56. Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
  57. Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
  58. Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
  59. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  60. Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55 (2011).
  61. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  62. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  63. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  64. Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
  65. Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
  66. Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
  67. Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
  68. Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
  69. Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
  70. Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).

Tags

Ex VivoCalcitonin Gene-related PeptideTrigeminovascular SystemRodentsTrigeminal Vascular SystemCGRP ReleaseTrigeminal NerveTrigeminal GanglionTrigeminal Nucleus CaudalisBrain DissectionBrainstemCerebellumCranium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., Kristensen, D. M., Christensen, S. L. Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents. J. Vis. Exp. (183), e63723, doi:10.3791/63723 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image