エクスビボ げっ歯類の三叉神経血管系からのカルシトニン遺伝子関連ペプチドの放出

すべての動物の世話と実験手順は、動物の世話と使用に関する欧州共同体ガイド(2010/63 / UE)に準拠して実施されました。このプロトコルを実証するために、10週齢の雄C57BL/6JBomTacマウスおよび10週齢の雄のSprague Dawleyラットを使用した。 1.合成間質液の調製 次のレシピに従って合成間質液(SIF)を調製する:108 mM NaCl、3.48 mM KCl、3.50 mM MgSO 4、26 mM NaHCO3、11.70 mM NaH 2 PO4、1.50 mM CaCl2、9.60 mM Na-グルコン酸塩、5.50 mMグルコースおよび7.60 mMスクロース(材料表を参照)。注:SIFは刺激ターゲットに応じて変えることができ、例えば、カルシウムチャネルを研究するときにカルシウムフリー溶液を使用することができます。 pHを7.4に調整し、カルボゲンガス(5%CO2および95%O2)46によってpHを安定させます。 2.安楽死 成体マウスおよびラットを70%CO2 および30%O2の混合物で麻酔する。はさみを使用してマウスを斬首し、ギロチンを使用してラットを斬首します( 材料の表を参照)。注:研究の目的に合った系統と年齢を使用してください。このモデルでは、男性と女性の両方を使用できます。 脊髄のC3-C4レベルで頭を体から分離します。注:安楽死は、ペントバルビタール(100-150 mg / kg)の腹腔内注射でも実行できます。. 3.解剖 以下の手順に従ってラット組織を準備します。はさみを使用して頭頸部の周りの皮膚と筋肉を取り除きます(図1A)。 骨トリマーとはさみを使用して、下顎を頭から分離します(図1B-C)。 椎骨の背部に尾側に挿入して脊髄を開き、椎骨の背側部分を取り外して脊髄と脳幹を露出させます(図1D)。 後頭骨と頭頂間骨の境界で頭蓋骨の尾側部分を切断し、小脳を露出しているこれらの骨構造を取り除きます(図1E)。注:脊椎を切断および除去する際に、脳幹と脊髄を傷つけないことが重要です。 脳幹の背外側部分をスプリングハサミで切断することにより、両側のブレグマから約13〜16 mm尾方向に走るTNC(Sp5C)を隔離します。左側と右側のTNCをSIFに浸します(図1E-I)。注:説明は成体ラットに対応しています。 のこぎりを使用して頭蓋骨を矢状に中央に切り、頭蓋骨を2つに分割します(図1J-L)。 ヘラを使って頭蓋に付着した硬膜に触れず、脳幹に入る三叉神経を切断することなく、慎重に脳を取り除きます(図1M-P)。 TGを分離するには、視覚的な境界線の周りの枝を含めてTGを切り取ります。卵円孔に入る下顎枝を切ります。頭蓋骨に入る眼科枝と上顎枝は巨視的に分割されていないため、切断します。TGを解剖しながら、TGを覆っている硬膜を取り外します(図1Q-T)。 頭蓋骨の半分とTGをSIFに浸します。 以下の手順に従ってマウス組織を準備します。小さなハサミを使用して頭頸部の周りの皮膚と筋肉を取り除きます(図2A-B)。 椎骨の背部に小さなハサミを尾側に挿入して脊髄を開き、椎骨の背側部分を削除して脊髄と脳幹を露出させます(図2C)。注意: 脊椎を切断して除去する際に脊髄を傷つけないことが重要です。 後頭骨と頭頂間骨の境界で頭蓋骨を切り取り、小脳を露出しているこれらの骨構造を取り除きます(図2D-F)。 次に、頭頂骨を矢状中央に切断し、骨を除去して大脳を露出させます(図2G-I)。 へらで小脳を慎重に取り除き、脳幹を露出させます(図2J)。 スプリングハサミを使用して脳幹のTNC含有部分を分離します(図2K-N)。脳幹をTNCでSIFに浸します(図2O)。 脳を取り出し、脳幹に入る三叉神経を切断します(図2P-Q)。 TGを分離するには、視覚的な境界線の周りの枝を含めてTGを切り取ります。卵円孔に入る下顎枝を切ります。頭蓋骨に入る眼科枝と上顎枝は巨視的に分割されていないため、切断します。TGを解剖しながら、TGを覆っている硬膜を取り外します(図2R-S)。 TGをSIFに浸します(図2T)。 4.洗濯 頭蓋骨の半分、TNC、およびTGをSIFで30分間洗浄し、室温で5分ごとにSIFを交換します。注意: 洗浄手順は、SIF交換を容易にするために、チュール蓋付きのプラスチック容器にティッシュを入れたまま実行できます(図3A-B)。 以下の手順に従ってラット組織を準備します。TNCの半分を350 μLのSIFで分離した微小遠心チューブキャップに移します(図3C)。 TGをマイクロ遠心チューブキャップに移します-350 μLのSIFを含むマイクロ遠心チューブキャップあたり1つのTG(図3C)。 頭蓋骨の半分を粘土または6ウェル培養プレート製のプラットフォームに置き、頭蓋骨に400 μLのSIFを満たします(図3C)。 以下の手順に従ってマウス組織を準備します。TNCを含む脳幹を、250 μLのSIFを含む微量遠心チューブキャップに移します(図3D)。 2つのTGを250 μLのSIFを含むマイクロ遠心チューブキャップに移します(図3D)。注:マウスの組織を使用する場合は、微量遠心チューブキャップごとに2つのTGを配置します。 ラットの頭蓋骨と微小遠心チューブキャップをラットとマウスの組織とともに、37°Cの加湿インキュベーターに入れます。 5分ごとにピペットを使用してSIFを20分間交換します。注意: SIFを追加および除去するときは、組織に触れないことが重要です。 5.薬物検査 基礎CGRP放出レベルを決定します。最後の洗浄後、250 μLのSIFをマウスTGおよびTNCに加えます。ラットTGおよびTNCに350 μL、各ラット頭蓋骨に400 μLを加えます。 10分間のインキュベーション後、200 μLのサンプルをマイクロ遠心チューブに集め、50 μLの10x EIAバッファー(CGRP酵素免疫測定キットに付属、 材料の表を参照)を加えて、基礎CGRP放出の測定を可能にします(ステップ6)。残りの液体を捨てます。注:インキュベーション時間はすべてのサンプルで同じでなければなりません。 直ちに、サンプルを-20°Cで保存してください。 基礎CGRP放出レベルのサンプリング後、3つの方法のいずれかに従います:(A)単一刺激(ステップ5.2);(b)濃度反応刺激(ステップ5.3);(C)刺激の阻害(ステップ5.4)(図4)。注:使用される試験化合物と濃度は、研究の目的によって異なります。 以下の手順に従って単回刺激を実行します。試験化合物またはビヒクルを組織に加え、10分間放置します(容量:マウスTGおよびTNCの場合は250 μL、ラットTGおよびTNCの場合は350 μL、各ラット頭蓋骨の場合は400 μL)。 10分間のインキュベーション後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを収集します。残りの液体を廃棄し、すぐにサンプルを-20°Cで保管してください。注:インキュベーション時間はすべてのサンプルで同じでなければなりません。 以下の手順に従って濃度反応刺激を実行します。試験化合物またはビヒクルを所望の濃度に希釈する。最低濃度から始めて、濃度を上げて試験化合物を追加します。注:使用される試験化合物と濃度は、研究の目的によって異なります。例えば、本研究では、1μM、10μM、および100μMのスーパーシンナムアルデヒドを使用しました。 試験化合物と対応するビヒクルの最低濃度(本研究では1 μM)を2つの同一の組織調製物に加え、10分間インキュベートします(容量:マウス組織で250 μL、ラットTGおよびTNCで350 μL、各ラット頭蓋骨で400 μL)。 10分間のインキュベーション後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを収集します。 残りの液体を廃棄し、2番目に低い濃度(本研究では10μM)を組織に追加します。 直ちに、サンプルを-20°Cで保存してください。 残りの濃度(本研究では100μM)でこの手順を繰り返します。 以下の手順で刺激の抑制を行います。ブロッカーまたはビヒクルを組織に加え、10分間インキュベートします(容量:マウス組織用に250 μL、ラットTGおよびTNC用に350 μL、および各ラット頭蓋骨に対して400 μL)。注:使用されるブロッカーと濃度は、研究の目的によって異なります。例えば、図 5の代表的な結果には3 μMのグリベンクラミドを使用しました。 10分間のインキュベーション後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを採取します。残りの液体を廃棄し、すぐにサンプルを-20°Cで保管してください。 アゴニストまたはアゴニスト+ブロッカー( 材料表を参照)を組織に加え、10分間インキュベートします。注:使用されるアゴニスト、ブロッカー、および濃度は、研究の目的によって異なります。本研究では、3 μMのグリベンクラミドと1 μMのカプサイシンを使用しました( 図5)。 10分間のインキュベーション後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを採取します。残りの液体を廃棄し、すぐにサンプルを-20°Cで保管してください。 実験のポジティブコントロールを実行します。必要に応じて、ポジティブコントロール(例:.、1〜10 μMのカプサイシン、 材料表を参照)をプロトコルの最後に組織に追加し、10分間のインキュベーション期間の後、50 μLの10x EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200 μLのサンプルを収集します。注:セットアップと組織が機能していることを確認するために、ポジティブコントロールを含めることが有利です。カプサイシン48,49,50またはカリウムの脱分極刺激(40-60mMのKCl)46,47,49は、三叉血管系からのCGRPの放出を引き起こすために日常的に使用される。40〜60mMのKCl SIFはSIFとして調製されるが、NaClは等モルベースでKClと交換される。 6. CGRP濃度の分析 メーカーのプロトコルに従って、酵素免疫測定法(EIA)キットを使用して放出されるCGRPの量を測定します(材料の表を参照)。 プレート光度計を使用して410nmでの光学密度を測定します。別のCGRP EIAキットを使用する場合は、製造元のプロトコルで提供されている波長で光学密度を測定します。注:サンプルは、検量線に一致するように希釈する必要があります。 データ分析を実行します。データを絶対濃度として提示するか、特定の組織からの基礎CGRP放出に正規化します。