Ex Vivo Libération d’un peptide lié au gène de la calcitonine du système trigéminovasculaire chez les rongeurs

Toutes les procédures de soins aux animaux et d’expérimentation ont été effectuées conformément au guide communautaire pour le soin et l’utilisation des animaux (2010/63/UE). Des souris C57BL/6JBomTac mâles, âgées de 10 semaines, et des rats Sprague Dawley mâles, âgés de 10 semaines, ont été utilisés pour démontrer ce protocole. 1. Préparation du liquide interstitiel synthétique Préparer le liquide interstitiel synthétique (SIF) selon la recette suivante : 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO4, 26 mM NaHCO 3, 11,70 mMNaH2PO4, 1,50 mM CaCl2, 9,60 mM Na-gluconate, 5,50 mM glucose et7,60 mM saccharose (voir tableau des matières).REMARQUE: Le SIF peut varier en fonction de la cible de stimulation, par exemple, une solution sans calcium peut être utilisée lors de l’étude des canaux calciques. Ajuster le pH à 7,4 et stabiliser le pH par gazage de carbogène (5 % de CO2 et 95 % d’O2)46. 2. Euthanasie Anesthésier les souris adultes et les rats avec un mélange de 70% de CO2 et 30% d’O2. Décapitater les souris à l’aide d’une paire de ciseaux et les rats à l’aide d’une guillotine (voir le tableau des matériaux).REMARQUE : Utilisez une souche et un âge qui correspondent à l’objectif de la recherche. Les mâles et les femelles peuvent être utilisés dans ce modèle. Séparez la tête du corps au niveau C3-C4 de la moelle épinière.NOTE: L’euthanasie peut également être réalisée avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (100-150 mg / kg). 3. Dissection Préparez le tissu de rat en suivant les étapes ci-dessous.Enlevez la peau et le muscle autour de la tête et du cou à l’aide d’une paire de ciseaux (Figure 1A). Utilisez une tondeuse et des ciseaux pour séparer les mâchoires inférieures de la tête (figure 1B-C). Ouvrez la moelle épinière en insérant une tondeuse osseuse caudale dans la partie dorsale des vertèbres et retirez la partie dorsale des vertèbres pour exposer la moelle épinière et le tronc cérébral (figure 1D). Couper la partie caudale du crâne par les bords des os occipital et interpariétal pour enlever ces structures osseuses exposant le cervelet (Figure 1E).REMARQUE: Il est important de ne pas endommager le tronc cérébral et la moelle épinière lors de la coupe et de l’enlèvement des vertèbres. Isoler le TNC (Sp5C) qui coule caudalement à environ 13-16 mm du bregma de chaque côté en coupant la partie dorsolatérale du tronc cérébral avec des ciseaux à ressort. Immergez le CTN gauche et droit dans le SFI (Figure 1E-I).NOTE: La description correspond à des rats adultes. Couper la tête à mi-sagitalement pour diviser le crâne en deux à l’aide d’une scie (figure 1J-L). Retirez délicatement le cerveau sans toucher la dure-mère attachée au crâne à l’aide d’une spatule et en coupant le nerf trijumeau à l’endroit où il pénètre dans le tronc cérébral (figure 1M-P). Pour isoler le TG, coupez-le, y compris ses branches autour des bordures visuelles. Couper la branche mandibulaire où elle pénètre dans le foramen ovale. Coupez les branches ophtalmiques et maxillaires entrant dans le crâne car elles ne sont pas divisées macroscopiquement. Lors de la dissection du TG, retirez la dure-mère qui recouvre le TG (Figure 1Q-T). Immergez les moitiés crâniennes et les TG dans SIF. Préparez le tissu de souris en suivant les étapes ci-dessous.Enlevez la peau et les muscles autour de la tête et du cou à l’aide de petits ciseaux (figure 2A-B). Ouvrez la moelle épinière en insérant une paire de petits ciseaux caudale dans la partie dorsale des vertèbres et retirez la partie dorsale des vertèbres pour exposer la moelle épinière et le tronc cérébral (figure 2C).REMARQUE: Il est important de ne pas endommager la moelle épinière lors de la coupe et de l’enlèvement des vertèbres. Couper le crâne par les bords des os occipital et interpariétal pour enlever ces structures osseuses exposant le cervelet (Figure 2D-F). Ensuite, coupez l’os pariétal à mi-sagital et retirez l’os pour exposer le cerveau (Figure 2G-I). Retirez délicatement le cervelet à l’aide d’une spatule pour exposer le tronc cérébral (figure 2J). Isoler la partie du tronc cérébral contenant du TNC à l’aide de ciseaux à ressort (Figure 2K-N). Immergez le tronc cérébral avec TNC dans SIF (Figure 2O). Retirez le cerveau et coupez le nerf trijumeau à l’endroit où il pénètre dans le tronc cérébral (Figure 2P-Q). Pour isoler le TG, coupez-le, y compris ses branches autour des bordures visuelles. Couper la branche mandibulaire où elle pénètre dans le foramen ovale. Coupez les branches ophtalmiques et maxillaires entrant dans le crâne car elles ne sont pas divisées macroscopiquement. Lors de la dissection du TG, retirez la dure-mère qui le recouvre (figure 2R-S). Immerger les TG dans le FSI (figure 2T). 4. Lavage Lavez les moitiés de crâne, les CTN et les TG dans le SIF pendant 30 minutes tout en remplaçant le SIF toutes les 5 minutes à température ambiante.REMARQUE : Les étapes de lavage peuvent être effectuées tout en conservant le mouchoir en papier dans des contenants en plastique munis d’un couvercle en tulle pour faciliter l’échange des SIF (figure 3A-B). Préparez le tissu de rat en suivant les étapes ci-dessous.Transférer les moitiés de TNC dans des bouchons de tubes microcentrifugés séparés contenant 350 μL de SIF (figure 3C). Transférer les TG dans des bouchons de tubes de microcentrifugeuses – un TG par bouchon de tube de microcentrifugeuse contenant 350 μL de SIF (figure 3C). Placez les moitiés du crâne sur des plates-formes faites d’argile ou d’une plaque de culture à 6 puits et remplissez le crâne avec 400 μL de SIF (figure 3C). Préparez le tissu de souris en suivant les étapes ci-dessous.Transférer le tronc cérébral contenant du TNC dans un bouchon de tube de microcentrifugeuse contenant 250 μL de SIF (figure 3D). Transférer les deux TG dans un bouchon de tube de microcentrifugeuse contenant 250 μL de SIF (figure 3D).REMARQUE : Placez deux TG par bouchon de tube de microcentrifugeuse lorsque vous utilisez du tissu de souris. Placer les crânes de rats et les capsules de tubes microcentrifugeuses avec du tissu de rat et de souris dans un incubateur humidifié à 37 °C. Remplacez SIF à l’aide d’une pipette toutes les 5 minutes pendant 20 min.REMARQUE: Il est important de ne pas toucher le tissu lors de l’ajout et du retrait du SIF. 5. Dépistage des drogues Déterminez les niveaux de libération du CGRP basal.Après le dernier lavage, ajouter 250 μL de SIF à la souris TG et TNC. Ajouter 350 μL à la TG et au TNC du rat et 400 μL à chaque crâne de rat. Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 μL de l’échantillon dans un tube microcentrifuge et ajouter 50 μL de tampon EIA 10x (fourni avec la trousse d’immunodosage enzymatique CGRP, voir Tableau des matériaux) pour permettre la mesure de la libération basale de CGRP (étape 6). Jetez le liquide restant.REMARQUE : Le temps d’incubation doit être le même pour tous les échantillons. Conserver immédiatement les échantillons à -20 °C. Après échantillonnage des niveaux de libération de CGRP basaux, suivre l’une des trois méthodes suivantes : (A) stimulation unique (étape 5.2); (B) Stimulation concentration-réponse (étape 5.3); et (C) Inhibition de la stimulation (étape 5.4) (Figure 4).NOTE: La substance d’essai et les concentrations utilisées dépendent de l’objectif de l’étude. Effectuez une stimulation unique en suivant les étapes ci-dessous.Ajouter le composé d’essai ou le véhicule dans le tissu et laisser reposer pendant 10 minutes (volume : 250 μL pour le TG et le TNC de souris, 350 μL pour le TG et le TNC du rat, et 400 μL pour chaque crâne de rat). Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 μL de l’échantillon dans un tube à microcentrifugation avec 50 μL de tampon EIA 10x. Jeter le liquide restant et conserver immédiatement les échantillons à -20 °C.REMARQUE : Le temps d’incubation doit être le même pour tous les échantillons. Effectuez une stimulation concentration-réponse en suivant les étapes ci-dessous.Diluer la substance d’essai ou le véhicule aux concentrations souhaitées. Ajouter la substance d’essai à des concentrations croissantes en commençant par la concentration la plus faible.NOTE: La substance d’essai et les concentrations utilisées dépendent de l’objectif de l’étude. Par exemple, des supercinnamaldéhydes de 1 μM, 10 μM et 100 μM ont été utilisés pour la présente étude. Ajouter la concentration la plus faible (1 μM pour la présente étude) de la substance d’essai et du véhicule correspondant à deux préparations tissulaires identiques et incuber pendant 10 min (volume : 250 μL pour le tissu de souris, 350 μL pour le TG et le TNC du rat, et 400 μL pour chaque crâne de rat). Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 μL de l’échantillon dans un tube à microcentrifugation avec 50 μL de tampon EIA 10x. Jeter le liquide restant et ajouter la deuxième concentration la plus faible (10 μM pour la présente étude) dans le tissu. Conserver immédiatement les échantillons à -20 °C. Répéter cette procédure avec les concentrations restantes (100 μM pour la présente étude). Effectuer l’inhibition de la stimulation en suivant les étapes ci-dessous.Ajouter le bloqueur ou le véhicule au tissu et incuber pendant 10 min (volume : 250 μL pour le tissu de souris, 350 μL pour le TG et le TNC du rat, et 400 μL pour chaque crâne de rat).NOTE: Le bloqueur et la concentration utilisés dépendent de l’objectif de l’étude. Par exemple, 3 μM de glibenclamide ont été utilisés pour le résultat représentatif de la figure 5. Après 10 min d’incubation, prélever un échantillon de 200 μL dans un tube microcentrifuge avec 50 μL de tampon EIA 10x. Jeter le liquide restant et conserver immédiatement les échantillons à -20 °C. Ajouter l’agoniste ou l’agoniste + bloqueur (voir tableau des matières) au tissu et incuber pendant 10 min.NOTE: L’agoniste, le bloqueur et les concentrations utilisés dépendent de l’objectif de l’étude. Dans la présente étude, 3 μM de glibenclamide et 1 μM de capsaïcine ont été utilisés, Figure 5. Après 10 min d’incubation, prélever un échantillon de 200 μL dans un tube microcentrifuge avec 50 μL de tampon EIA 10x. Jeter le liquide restant et conserver immédiatement les échantillons à -20 °C. Effectuez un contrôle positif pour l’expérience.S’il y a lieu, ajouter un témoin positif (p. ex. 1 à 10 μM de capsaïcine, voir le tableau des matières) au tissu à la fin du protocole et prélever un échantillon de 200 μL dans un tube à microcentrifugation contenant 50 μL de tampon EIA 10x après une période d’incubation de 10 minutes.REMARQUE: Il est avantageux d’inclure un contrôle positif pour s’assurer que la configuration et les tissus fonctionnent. La capsaïcine 48,49,50 ou le stimulus dépolarisant du potassium (40-60 mM de KCl)46,47,49 sont couramment utilisés pour provoquer la libération de CGRP par le système trigéminovasculaire. 40-60 mM de KCl SIF sont préparés sous forme de SIF, sauf que le NaCl est échangé contre KCl sur une base équimolaire. 6. Analyse des concentrations de CGRP Mesurer la quantité de CGRP libérée à l’aide d’une trousse d’immunodosage enzymatique (EIA) en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux). Mesurer la densité optique à 410 nm à l’aide d’un photomètre à plaques. Si un autre kit EIA CGRP est utilisé, mesurez la densité optique à la longueur d’onde indiquée dans le protocole du fabricant.REMARQUE : Les échantillons doivent être dilués pour correspondre à la courbe standard. Effectuer une analyse des données.Présenter les données sous forme de concentrations absolues ou normaliser la libération basale de CGRP par le tissu spécifique.