JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Ex Vivo | Afgifte van calcitonine-gengerelateerd peptide uit het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren

Published: May 16, 2022
doi:
10.3791/63723
, , ,
1Danish Headache Center, Department of Neurology,Rigshospitalet, University of Copenhagen, 2EHESP, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail),Univ Rennes, Inserm, 3Department of Biology, Section of Cell Biology and Physiology,University of Copenhagen

Summary

Het huidige protocol beschrijft het ex vivo calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) release model en de strategie om het effect van farmacologische middelen op de hoeveelheid CGRP vrij te maken van het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren te kwantificeren.

Abstract

Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) werd voor het eerst ontdekt in de jaren 1980 als een splice variant van het calcitonine gen. Sinds de ontdekking is zijn rol in de pathofysiologie van migraine goed ingeburgerd, eerst door zijn krachtige vaatverwijdende eigenschappen en vervolgens door zijn aanwezigheid en functie als neurotransmitter in het sensorische trigeminovasculaire systeem. Het migraine-provocerende vermogen van CGRP gaf ondersteuning aan de farmaceutische industrie om monoklonale antilichamen en antagonisten te ontwikkelen die het effect van CGRP remmen. Een nieuw behandelingsparadigma is effectief gebleken bij de profylactische behandeling van migraine. Een van de nuttige hulpmiddelen om migrainemechanismen verder te begrijpen, is het ex vivo model van CGRP-afgifte uit het trigeminovasculaire systeem. Het is een relatief eenvoudige methode die met verschillende farmacologische hulpmiddelen kan worden gebruikt om kennis te verwerven om nieuwe effectieve migrainebehandelingen verder te ontwikkelen. Het huidige protocol beschrijft een CGRP-afgiftemodel en de techniek om het effect van farmacologische middelen op de hoeveelheid CGRP die vrijkomt uit het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren te kwantificeren. Er wordt een procedure gegeven die de experimentele aanpak beschrijft, van euthanasie tot het meten van eiwitniveaus. De essentiële isolatie van het trigeminus ganglion en de trigeminuskern caudalis van zowel muizen als ratten en de bereiding van rat dura mater worden in detail beschreven. Verder worden representatieve resultaten van beide soorten (ratten en muizen) gepresenteerd. De techniek is een belangrijk hulpmiddel om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij migraine pathofysiologie door gebruik te maken van verschillende farmacologische verbindingen en genetisch gemodificeerde dieren.

Introduction

Migraine is een neurologische aandoening die volgens de WHO naar schatting meer dan 1 miljard mensen treft en wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van invaliditeit is1. Migraine heeft dus een aanzienlijke impact op zowel patiënten als de samenleving. Ondanks het recente klinische succes van CGRP-antagoniserende geneesmiddelen, heeft een groot deel van de patiënten verbeterde behandelingsopties nodig 2,3,4,5. Opheldering van migraine pathofysiologie die leidt tot nieuwe effectieve behandelingen is vereist. Signalering binnen het trigeminovasculaire systeem bestaande uit de hersenvliezen, trigemminale ganglia (TG) en trigemminale nucleus caudalis (TNC) is centraal voor migraine pathofysiologie 6,7.

Het 37 aminozuur neuropeptide calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) werd voor het eerst ontdekt in de vroege jaren 1980 toen Amara en collega’s aantoonden dat het primaire RNA-transcript van het calcitonine-gen kon worden verwerkt om mRNA-codering voor CGRP te geven naast calcitonine 8,9. Het daaropvolgende onderzoek suggereerde een verband met migraine pathofysiologie10. CGRP is een neurotransmitter met krachtige vaatverwijdende eigenschappen 11,12,13,14,15,16,1 7, en het is wijd verspreid in het centrale en perifere zenuwstelsel 13,14,18,19,20,21,22 . De betrokkenheid van CGRP bij migraine werd onderstreept met de ontdekking van verhoogde CGRP-niveaus in de extracerebrale circulatie tijdens migraineaanvallen bij mensen23, en dat infusie van CGRP migraine-achtige pijn veroorzaakt bij patiënten24. Twee jaar later werd de eerste proof-of-concept studie van de effectiviteit van de CGRP-antagonist olcegepant bij de behandeling van migraine gepubliceerd25.

CGRP is overvloedig aanwezig in het trigeminovasculaire systeem zoals aangetoond in de TG21,26, sensorische zenuwvezels die de dura mater 27,28,29 en TNC30 innerveren. In het trigeminovasculaire systeem wordt CGRP gevonden in de kleine tot middelgrote neuronen van de TG, in niet-gemyeliniseerde C-vezels, en wordt uitgedrukt in bijna 50% van de neuronale populatie van de TG. De CGRP-receptor komt voornamelijk tot expressie in grotere neuronen en wordt aangetroffen in gemyeliniseerde Aδ-vezels 31,32. CGRP komt vrij uit neuronen bij chemische of elektrische stimulatie33,34. Studies van pathways die leiden tot de afgifte van CGRP en de locatie van deze activering zijn cruciaal om migraine pathofysiologie te begrijpen. In de afgelopen 5 decennia hebben preklinische studies bijgedragen aan het verkrijgen van uitgebreide kennis over migraine-gerelateerde signalering en hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van nieuwe behandelingen35. Veel methoden die rekening houden met de vasculaire en neurogene betrokkenheid zijn aangepast en toegepast in migraineonderzoek. In vivo en in vitro modellen van arteriële reacties op biologische verbindingen of farmacologische behandelingen 17,36,37, en elektrische zenuwstimulatie 38,39 kunnen worden genoemd. Bovendien kunnen geactiveerde neuronen in de TNC worden gedetecteerd door c-Fos-expressie 40,41,42 en elektrofysiologische opnames in dit gebied 43,44. Beide methoden meten nociceptieve signalen die vanuit het hoofd naar de hersenen worden verzonden, bijvoorbeeld dura mater. Het gebruik van slechts één preklinisch model geeft niet het volledige beeld van migraine pathofysiologie. Daarom is het belangrijk om verschillende modellen te combineren die zoveel mogelijk aspecten van migraine pathofysiologie bestrijken. De verdere ontwikkeling van nieuwe modellen zal verschillende aspecten van migrainemechanismen omvatten en op termijn zal het mysterie van migrainepathofysiologie worden blootgelegd.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd van de CGRP-afgiftemethode, ex vivo uitgevoerd in geïsoleerde TG en TNC van muizen na chemische stimulatie. CGRP-afgifte kan ook worden bestudeerd in de dura mater van ratten. Zo wordt in het experimentele protocol voor ratten dura mater samen met TG en TNC beschreven. De basis voor de CGRP-releasemethode werd voor het eerst beschreven in 1999, waar Ebersberger en collega’s baanbrekend onderzoek deden en ontdekten dat CGRP vrijkwam uit dura mater na chemische en elektrische stimulatie van durarale afferente stoffen bij ratten45. Later werd deze aanpak uitgebreid naar CGRP-release van de TG46 en de TNC47. Vervolgens werd de methode aangepast om toe te passen op TG en TNC bij muizen. Tot nu toe is de CGRP-afgifte van de dura mater een uitdaging geweest bij muizen.

Protocol

Alle dierverzorgings- en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de gids van de Europese Gemeenschap voor de verzorging en het gebruik van dieren (2010/63/UE). Mannelijke C57BL/6JBomTac-muizen, 10 weken oud, en mannelijke Sprague Dawley-ratten, 10 weken oud, werden gebruikt om dit protocol te demonstreren. 1. Bereiding van de synthetische interstitiële vloeistof Bereid synthetische interstitiële vloeistof (SIF) volgens het volgende recept: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 11,70 mM NaH2PO4, 1,50 mM CaCl2, 9,60 mM Na-gluconaat, 5,50 mM glucose en 7,60 mM sucrose (zie Materiaaltabel).OPMERKING: SIF kan worden gevarieerd afhankelijk van het stimulatiedoel, bijvoorbeeld een calciumvrije oplossing kan worden gebruikt bij het bestuderen van calciumkanalen. Stel de pH in op 7,4 en stabiliseer de pH door carbogenvergassing (5% CO2 en 95% O2)46. 2. Euthanasie Verdoof volwassen muizen en ratten met een mengsel van 70% CO2 en 30% O2. Onthoofd muizen met een schaar en ratten met een guillotine (zie Materiaaltabel).OPMERKING: Gebruik een soort en leeftijd die past bij het doel van het onderzoek. Zowel mannetjes als vrouwtjes kunnen in dit model worden gebruikt. Scheid het hoofd van het lichaam op het C3-C4-niveau van het ruggenmerg.OPMERKING: Euthanasie kan ook worden uitgevoerd met een intraperitoneale injectie van pentobarbital (100-150 mg / kg). 3. Dissectie Bereid het rattenweefsel voor volgens de onderstaande stappen.Verwijder de huid en de spier rond het hoofd en de nek met een schaar (figuur 1A). Gebruik een bottentrimmer en een schaar om de onderkaken van het hoofd te scheiden (figuur 1B-C). Open het ruggenmerg door een bottrimmer caudally in het dorsale deel van de wervels in te brengen en verwijder het dorsale deel van de wervels om het ruggenmerg en de hersenstam bloot te leggen (figuur 1D). Snijd het caudale deel van de schedel door de randen van de occipitale en interpariëtale botten om deze botstructuren te verwijderen die het cerebellum blootleggen (figuur 1E).OPMERKING: Het is belangrijk om de hersenstam en het ruggenmerg niet te beschadigen tijdens het snijden en verwijderen van de wervels. Isoleer de TNC (Sp5C) caudally ongeveer 13-16 mm van de bregma aan elke kant door het dorsolaterale deel van de hersenstam met een veerschaar door te knippen. Dompel de linker- en rechterkant TNC onder in SIF (figuur 1E-I).OPMERKING: De beschrijving komt overeen met volwassen ratten. Zaag de kop halverwege de spits om de schedel in tweeën te delen met behulp van een zaag (figuur 1J-L). Verwijder de hersenen voorzichtig zonder de dura mater aan te raken die met een spatel aan de schedel is bevestigd en snijd de trigeminuszenuw door waar deze de hersenstam binnendringt (figuur 1M-P). Om de TG te isoleren, snijdt u deze, inclusief de takken rond de visuele randen. Knip de mandibulaire tak af waar deze in het foramen ovale komt. Snijd de oogheelkundige en maxillaire takken die de schedel binnenkomen, omdat ze niet macroscopisch zijn verdeeld. Verwijder tijdens het ontleden van de TG de dura mater die de TG bedekt (figuur 1Q-T). Dompel de schedelhelften en de TG’s onder in SIF. Bereid het muizenweefsel voor volgens de onderstaande stappen.Verwijder huid en spieren rond het hoofd en de nek met een kleine schaar (figuur 2A-B). Open het ruggenmerg door een paar kleine scharen caudaal in het dorsale deel van de wervels in te brengen en verwijder het dorsale deel van de wervels om het ruggenmerg en de hersenstam bloot te leggen (figuur 2C).OPMERKING: Het is belangrijk om het ruggenmerg niet te beschadigen tijdens het snijden en verwijderen van de wervels. Snijd de schedel door de randen van de occipitale en interpariëtale botten om deze botstructuren te verwijderen die het cerebellum blootleggen (figuur 2D-F). Snijd vervolgens het pariëtale bot halverwege sagittaal en verwijder het bot om het cerebrum bloot te leggen (figuur 2G-I). Verwijder het cerebellum voorzichtig met een spatel om de hersenstam bloot te leggen (figuur 2J). Isoleer het TNC-bevattende deel van de hersenstam met een veerschaar (figuur 2K-N). Dompel de hersenstam met TNC onder in SIF (figuur 2O). Verwijder de hersenen en snijd de nervus trigeminus af waar deze de hersenstam binnendringt (figuur 2P-Q). Om de TG te isoleren, snijdt u deze, inclusief de takken rond de visuele randen. Knip de mandibulaire tak af waar deze in het foramen ovale komt. Snijd de oogheelkundige en maxillaire takken die de schedel binnenkomen, omdat ze niet macroscopisch zijn verdeeld. Verwijder tijdens het ontleden van de TG de dura mater die de TG bedekt (figuur 2R-S). Dompel DE TG’s onder in SIF (figuur 2T). 4. Wassen Was schedelhelften, TNC’s en TG’s in SIF gedurende 30 minuten terwijl u de SIF elke 5 minuten bij kamertemperatuur vervangt.OPMERKING: De wasstappen kunnen worden uitgevoerd terwijl het weefsel in plastic containers met een tule deksel wordt bewaard om eenvoudige SIF-uitwisseling mogelijk te maken (figuur 3A-B). Bereid het rattenweefsel voor volgens de onderstaande stappen.Breng TNC-helften over naar afzonderlijke buisdoppen van microcentrifuges met 350 μL SIF (figuur 3C). Breng de TG’s over naar buisdoppen van microcentrifuges – één TG per buisdop van de microcentrifuge met 350 μL SIF (figuur 3C). Plaats de schedelhelften op platforms gemaakt van klei of een 6-well kweekplaat en vul de schedel met 400 μL SIF (figuur 3C). Bereid het muizenweefsel voor volgens de onderstaande stappen.Breng de hersenstam met TNC over naar een microcentrifuge buisdop met 250 μL SIF (figuur 3D). Breng de twee TG’s over naar een buisdop van een microcentrifuge met 250 μL SIF (figuur 3D).OPMERKING: Plaats twee TG’s per buisdop van de microcentrifuge bij gebruik van weefsel van muizen. Plaats rattenschedels en microcentrifuge buisdoppen met ratten- en muizenweefsel in een bevochtigde incubator bij 37 °C. Vervang SIF met een pipet om de 5 minuten gedurende 20 minuten.OPMERKING: Het is belangrijk om het weefsel niet aan te raken bij het toevoegen en verwijderen van SIF. 5. Drugstesten Bepaal de basale CGRP-afgifteniveaus.Voeg na de laatste wasbeurt 250 μL SIF toe aan muis-TG en TNC. Voeg 350 μL toe aan rat TG en TNC en 400 μL aan elke rattenschedel. Verzamel na 10 minuten incubatie 200 μL van het monster in een microcentrifugebuis en voeg 50 μL 10x EIA-buffer toe (geleverd met de CGRP-enzymimmunoassaykit, zie Materiaaltabel) om meting van de basale CGRP-afgifte mogelijk te maken (stap 6). Gooi de resterende vloeistof weg.OPMERKING: De incubatietijd moet voor alle monsters hetzelfde zijn. Bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C. Na bemonstering van basale CGRP-afgifteniveaus volgt u een van de drie methoden: (A) Enkelvoudige stimulatie (stap 5.2); (B) Concentratie-responsstimulatie (stap 5.3); en (C) Remming van stimulatie (stap 5.4) (figuur 4).OPMERKING: De gebruikte teststof en concentraties zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek. Voer een enkele stimulatie uit volgens de onderstaande stappen.Voeg het testmiddel of medium toe aan het weefsel en laat het 10 minuten staan (volume: 250 μL voor muis TG en TNC, 350 μL voor ratten TG en TNC en 400 μL voor elke rattenschedel). Verzamel na 10 minuten incubatie 200 μL van het monster in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer. Gooi de resterende vloeistof weg en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C.OPMERKING: De incubatietijd moet voor alle monsters hetzelfde zijn. Voer concentratie-responsstimulatie uit volgens de onderstaande stappen.Verdun het testmiddel of medium tot de gewenste concentraties. Voeg de teststof toe in toenemende concentraties, te beginnen met de laagste concentratie.OPMERKING: De gebruikte teststof en concentraties zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek. Voor deze studie werden bijvoorbeeld 1 μM, 10 μM en 100 μM supercinnamaldehyde gebruikt. Voeg de laagste concentratie (1 μM voor dit onderzoek) van het testmiddel en het overeenkomstige medium toe aan twee identieke weefselpreparaten en incubeer gedurende 10 minuten (volume: 250 μL voor muizenweefsel, 350 μL voor rat TG en TNC en 400 μL voor elke rattenschedel). Verzamel na 10 minuten incubatie 200 μL van het monster in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer. Gooi de resterende vloeistof weg en voeg de op een na laagste concentratie (10 μM voor dit onderzoek) toe aan het weefsel. Bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C. Herhaal deze procedure met de resterende concentraties (100 μM voor dit onderzoek). Voer remming van stimulatie uit volgens de onderstaande stappen.Voeg de blokker of het medium toe aan het weefsel en incubeer gedurende 10 minuten (volume: 250 μL voor muizenweefsel, 350 μL voor ratten TG en TNC en 400 μL voor elke rattenschedel).OPMERKING: De gebruikte blokker en concentratie zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek. Zo werd 3 μM glibenclamide gebruikt voor het representatieve resultaat in figuur 5. Verzamel na 10 minuten incubatie een monster van 200 μL in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer. Gooi de resterende vloeistof weg en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C. Voeg de agonist of agonist + blokker (zie materiaaltabel) toe aan het weefsel en incubeer gedurende 10 minuten.OPMERKING: De gebruikte agonist, blokker en concentraties zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek. In deze studie werd 3 μM glibenclamide en 1 μM capsaïcine gebruikt, figuur 5. Verzamel na 10 minuten incubatie een monster van 200 μL in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer. Gooi de resterende vloeistof weg en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C. Voer een positieve controle uit voor het experiment.Voeg indien van toepassing een positieve controle (bijv. 1-10 μM capsaïcine, zie materiaaltabel) toe aan het weefsel aan het einde van het protocol en verzamel een monster van 200 μL in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer na een incubatietijd van 10 minuten.OPMERKING: Het is voordelig om een positieve controle op te nemen om ervoor te zorgen dat de opstelling en weefsels functioneren. Capsaïcine 48,49,50 of de depolariserende stimulus van kalium (40-60 mM KCl)46,47,49 worden routinematig gebruikt om de afgifte van CGRP uit het trigeminovasculaire systeem te veroorzaken. 40-60 mM KCl SIF wordt bereid als SIF, behalve dat NaCl op equimolar basis wordt omgewisseld voor KCl. 6. Analyse van CGRP-concentraties Meet de hoeveelheid CGRP die vrijkomt met behulp van een enzymimmunoassay (EIA) -kit volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel). Meet de optische dichtheid bij 410 nm met behulp van een plaatfotometer. Als een andere CGRP EIA-kit wordt gebruikt, meet u de optische dichtheid op de golflengte die is aangegeven in het protocol van de fabrikant.OPMERKING: Monsters moeten worden verdund om overeen te komen met de standaardcurve. Voer gegevensanalyse uit.Presenteer de gegevens als absolute concentraties of normaliseer naar de basale CGRP-afgifte van het specifieke weefsel.

Representative Results

Deze techniek is een hulpmiddel om de CGRP-gerelateerde moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij migraine te onderzoeken. Het heeft het voordeel dat het de CGRP-afgifte van verschillende niveaus van het trigeminovasculaire systeem beoordeelt en kan zowel op wildtype als transgene muizen en ratten worden toegepast in combinatie met verschillende farmacologische verbindingen. Hier worden concentratie-respons- en blokkeringsexperimenten van ratten en concentratieresponsresultaten van wildtype en transgene muizen gepresenteerd. De CGRP-afgiftemethode werd gebruikt om het effect van de KATP-kanaalremmer glibenclamide op de CGRP-afgifte van TG en dura mater bij vrouwelijke spontane trigeminusallodynische (STA) ratten te bestuderen. Ten eerste werd de optimale concentratie capsaïcine gevonden met behulp van een concentratie-respons studieontwerp. Blootstelling aan capsaïcine veroorzaakte een significante CGRP-afgifte van dura mater en TG in vergelijking met het medium (figuur 5). In de dura mater werd de maximale afgifte van CGRP gevonden bij 1 μM capsaïcine en in TG werd de maximale CGRP-afgifte gevonden bij 10 μM capsaïcine (figuur 5A-B). Op basis van de concentratie-responsexperimenten werd 1 μM capsaïcine en 3 μM glibenclamide gebruikt voor het blokkeren van experimenten. Glibenclamide vertoonde geen effect op de basale CGRP-afgifte van dura mater (P = 0,441) en TG (P = 0,881) bij analyse met een eenrichtings-ANOVA51. Glibenclamide verminderde significant de capsaïcine-geïnduceerde CGRP-afgifte in dura mater met 40% (P = 0,031) en TG met 39% (P = 0,003) in vergelijking met capsaïcine met het medium wanneer geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA (figuur 5C-D)51. Bij muizen werd het protocol gebruikt om de betrokkenheid van het transiënte receptorpotentiaal ankyrine 1 (TRPA1) ionkanaal te onderzoeken in een GTN-muismodel van migraine, waarbij GTN-geïnduceerde overgevoeligheid volledig afhankelijk was van TRPA1-kanalen. De TRPA1-agonist supercinnamaldehyde (SCA) bleek CGRP op een dosisafhankelijke manier vrij te geven aan de TG met 1 μM, 10 μM en 100 μM SCA, wat resulteerde in 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) en 69% (P = 0,0097) verhoogde afgifte van CGRP in vergelijking met het voertuig, respectievelijk wanneer geanalyseerd met tweeweg ANOVA. Deze afgifte was afwezig in TG van Trpa1 nulmuizen waar blootstelling aan 1 μM, 10 μM en 100 μM SCA resulteerde in 11% (P > 0,99), -13% (P > 0,99) en 9% (P = 0,97) procent verandering in de afgifte van CGRP in vergelijking met het voertuig, respectievelijk wanneer geanalyseerd met tweeweg ANOVA. De daaropvolgende stimulatie met 10 μM capsaïcine (positieve controle) laat zien dat alle weefselmonsters CGRP kunnen afgeven (figuur 6)50. Figuur 1: Stapsgewijze dissectie van weefsel van ratten. De (A-T) details worden verstrekt in de protocolsectie (stap 3.1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Stapsgewijze dissectie van weefsel van muizen. De (A-T) details worden verstrekt in de protocolsectie (stap 3.2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Wassen en incubatie van knaagdierweefsel. (A-B) Vers geïsoleerd weefsel in plastic containers met SIF. De containers zijn bedekt met tule om SIF eenvoudig te kunnen verwisselen. (C) Rattenweefsel – Twee schedelhelften met dura mater die de binnenvoeringen van de schedel bedekken, geplaatst op een 6-well kweekplaat. De rechter en linker trigeminuskern caudalis in afzonderlijke microcentrifuge buisdeksels (bovenste rij deksels). De twee trigeminus ganglia in individuele microcentrifuge buisdeksels (onderste rij deksels). (D) Muizenweefsel – De trigeminuskern caudalis-bevattend deel van de hersenstam in een apart microcentrifuge buisdeksel (boven). Twee trigeminus ganglia van muizen bevinden zich in één microcentrifuge buisdeksel (onderkant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Studieontwerpen voor CGRP-release. Drie verschillende protocollen voor het uitvoeren van CGRP-release-experimenten. Geneesmiddelen moeten worden verdund in synthetische interstitiële vloeistof (SIF). (A) Eenmalige stimulatie. (B) Concentratie-respons stimulatie. (C) Remming van een stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Glibenclamide remt capsaïcine-geïnduceerde CGRP-afgifte van rat dura mater en trigeminus ganglion. CGRP-niveaus van trigeminus ganglion en dura mater geïsoleerd van vrouwelijke spontane trigeminus allodynische (STA) ratten (215-318 g) oorspronkelijk afkomstig van de Thomas Jefferson University52 werden gemeten met commerciële menselijke CGRP EIA-kits. (A-B) CGRP-afgifte uit (A) dura mater en (B) trigeminus ganglion na toenemende concentraties capsaïcine (10 nM, 100 nM, 1 μM en 10 μM) (n = 4). Gegevens worden gepresenteerd als individuele punten en werden geanalyseerd met tweerichtings-ANOVA. p < 0,0001 (C-D) niveaus van CGRP vrijgekomen uit (C) dura mater en (D) trigeminus ganglion na 10 minuten blootstelling aan het medium, 3 μM glibenclamide (glib), 1 μM capsaïcine en 1 μM capsaïcine + 3 μM glib (n = 6-11). Gegevens worden gepresenteerd als individuele punten en gemiddelde waarden en werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA. *vergeleken met voertuig. #capsaïcine vergeleken met capsaïcine + glib. #P < 0,05, ** en ##P < 0,01, ****P < 0,0001. De analyses werden gevolgd met de meervoudige vergelijkingstest van Bonferroni. Voor alle tests werd een significant niveau van α = 0,05 gebruikt. Dit cijfer is overgenomen uit Christensen et al. 51. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: SCA-blootstelling resulteert in TRPA1-afhankelijke CGRP-afgifte van trigeminus ganglion bij muizen. CGRP-niveaus die vrijkomen uit trigeminus ganglion geïsoleerd uit WT en Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 mannelijke muizen (8-10 weken) werden gemeten met CGRP EIA-kits van ratten na blootstelling aan supercinnamaldehyde (SCA) bij 1 μM, 10 μM en 100 μM en capsaïcine bij 10 μM als een positieve controle (n = 6). Gegevens van elke muis worden gepresenteerd als afzonderlijke punten en balken geven de gemiddelde waarden aan. Statistieken: Vergelijking tussen SCA en medium bij elke concentratie en tussen basale en positieve controle werd uitgevoerd met een tweerichtings herhaalde ANOVA. Een significant niveau van α = 0,05. *P < 0,05, **P < 0,01. Dit cijfer is overgenomen uit Christensen et al. 50. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De beschreven methode werd ontwikkeld na studies die het belang van CGRP in de pathofysiologie van migraine aantonen. Het is zeer geschikt voor het onderzoeken van de mechanismen die betrokken zijn bij het vrijkomen van CGRP uit het trigeminovasculaire systeem, wat cruciaal is voor pijnsignalering in het hoofdgebied. De hoeveelheid CGRP die in dit model wordt verkregen, meet rechtstreeks de CGRP-afgifte van de trigeminuszenuwen die dura mater, TG en TNC innerveren. De hoeveelheid CGRP-afgifte is kwantitatief groter45,54 dan de afgifte gemeten in plasma na thermocoagulatie bij mensen, trigeminusstimulatie bij kat 39,55,56 en tijdens migraineaanvallen23. Een verklaring zou kunnen zijn dat CGRP verdund en afgebroken wordt in het bloed54. Er moet echter worden opgemerkt dat directe stimulatie met chemicaliën superieur kan zijn aan pathofysiologische activering. Verdere voordelen zijn dat het mogelijk is om de afgifte van drie verschillende plaatsen in het trigeminovasculaire systeem te lokaliseren en dat het kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische manipulatie en in weefsel van genetisch gemodificeerde knaagdieren.

De laatste tijd richten veel preklinische knaagdiermodellen zich op systemische toediening van stoffen en daaropvolgende pijn- of migrainegerelateerde uitlezingen met behulp van von Frey-tests 57,58, grimassen 59,60,61 of lichtaversie 62,63,64. Deze methoden zijn nuttig bij het begrijpen van de pijnverwekkende en pijnstillende eigenschappen van verschillende stoffen. Deze benaderingen geven echter geen informatie over specifieke betrokken doelweefsels. In de huidige methode is het trigeminovasculaire systeem verdeeld in drie structuren: de dura mater, TG en TNC. Dit maakt lokale blootstelling van elke structuur en de beoordeling van de plaats van werking van een specifieke stof mogelijk. Dit werd gebruikt in een studie uit 2011, waar de rol van voltage-gated calciumkanalen bij ratten werd onderzocht, en de remming van deze kanalen bleek anders te zijn in de drie structuren van de trigeminovasculaire route47. Bij het ontleden van structuren van het zenuwstelsel is axotomie onvermijdelijk. Van axotomie is aangetoond dat het de transcriptie van verschillende genen verandert65. Deze transcriptionele veranderingen zijn te traag om de resultaten van deze methode te beïnvloeden, maar veranderingen in fosforylering kunnen niet worden uitgesloten in vergelijking met in vivo situaties46. Hoewel neuropeptiden zoals CGRP worden gevormd in de cel soma, zijn de afgifte en werking van neuropeptiden meestal op de centrale of perifere zenuwterminals. Studies van intacte neuronen, inclusief terminals, zijn dus interessant bij het bestuderen van de afgifte van neuropeptiden. Daarom zijn methoden voor het bestuderen van culturen van neuronen uit geïsoleerde ganglia vastgesteld om te dienen als een model van de terminals. Neuronale celculturen zijn echter onderhevig aan verschillende problemen, omdat mechanische dissociatie neuronen in een cultuur kan vernietigen46. Het langere tijdsbestek dat gepaard gaat met het kweken van cellen laat deze methode gevoelig voor transcriptomische veranderingen als gevolg van axotomie en kweekomstandigheden65. Bovendien hebben de toevoeging van groeifactoren en het kweken op oppervlaktecoatings neuronale eigenschappen als zender- en receptorexpressie veranderd 66,67,68,69. Deze problemen worden vermeden bij het bestuderen van vers geïsoleerde intacte ganglia in plaats van neuronale celculturen.

Een uitdaging bij de ex vivo CGRP-afgiftemethode is de precieze dissectie van het weefsel dat nodig is voor reproduceerbare resultaten. Vooral nauwkeurige dissectie van de TNC is een uitdaging omdat dit een structuur in de hersenstam is zonder zichtbare grenzen. Bovendien is de dura mater kwetsbaar en moet het verwijderen van de hersenen zorgvuldig worden uitgevoerd om een intacte structuur te garanderen. Deze obstakels kunnen resulteren in verschillende weefselgrootte en dus variërende basale en stimulatie-geïnduceerde CGRP-niveaus. Deze variatie kan echter worden verklaard door normalisatie naar de basale CGRP-afgifte. Er moet ook worden opgemerkt dat bij het isoleren van de TNC van muizen het hele onderste deel van de hersenstam wordt geïsoleerd en niet het meer specifieke TNC-bevattende deel zoals bij ratten wordt gedaan. Over het algemeen kan het een voordeel zijn om rattenweefsel te gebruiken, omdat dit het mogelijk maakt om de CGRP-afgifte van dura mater en de nauwkeurigere dissectie van de TNC te meten. Bovendien maakt de grootte van het weefsel ook het gebruik van een rat als voertuigcontrole mogelijk, aangezien één rat resulteert in twee schedelhelften, twee TG’s en twee TNC’s waarbij een stuk van het weefsel wordt gebruikt voor stofstimulatie en de andere voor het voertuig. Bij het gebruik van muizen zijn twee dieren nodig voor één experiment, omdat beide TG’s in één monster worden samengevoegd en de TNC’s worden ontleed als één hersenstam. Daarom worden twee TG’s en een hersenstam gebruikt voor stofstimulatie en worden twee TG’s en een hersenstam van een andere muis gebruikt voor voertuigbesturing. Dit resulteert in het gebruik van twee keer zoveel muizen in vergelijking met ratten om hetzelfde aantal replicaties te verkrijgen. Om het aantal gebruikte muizen te verminderen, is een methode voorgesteld om de CGRP-afgifte uit hersenstamsegmenten te meten49. Het is een voordeel dat de methode is aangepast om het gebruik van muizen mogelijk te maken. Dit maakt het gebruik van veel reeds beschikbare transgene muizenstammen mogelijk, een handig hulpmiddel voor het bestuderen van bijvoorbeeld signaalroutes. Een positieve controle aan het einde van een experiment moet worden opgenomen om ervoor te zorgen dat het weefsel dat in het experiment wordt gebruikt CGRP kan vrijgeven. De positieve controle zou TRPV1-agonist capsaïcine of de depolariserende stimuluskalium (KCl) kunnen zijn, waarvan is gebleken dat CGRP vrijkomt uit het trigeminovasculaire systeem bij zowel muizen als ratten 46,47,48,49,50. Bovendien is de methode ook aangepast om de afgifte van andere relevante peptiden te meten als hypofyse-adenylaatcyclase-activerend peptide (PACAP) – een ander peptide van groot belang binnen migraineonderzoek70.

De methode biedt een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van CGRP-afgifte van specifieke doelweefsels bij ratten en muizen. Het is een relatief snelle methode die problemen in verband met het kweken van neuronen voorkomt. Het methodeprotocol kan eenvoudig worden aangepast om de concentratie-responsrelatie of remming van een respons door verschillende farmacologische verbindingen te bestuderen. De ex vivo CGRP-afgiftemethode is een van de verschillende preklinische methoden die nuttig zijn voor het bestuderen van de rol van CGRP en andere mechanismen die verband houden met CGRP-afgifte in migrainepathofysiologie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door Candys Foundation.

Materials

6-well culture plate NUNC 140675
Calcium chloride dihydrate Merck 1.02382.1000 For SIF buffer
Caps for plastic containers ThermoFisher Scientific 536617
Capsaicin Merck M2028
CGRP kits AH Diagnostics A05482.96
CO2 Strandmøllen 4.6 For carbogen gassing of SIF
Delicate Bone Trimmer Fine Science Tools 16109-14
Glibenclamide Tocris 911
Glucose Merck G7021 For SIF buffer
Guillotine for rats Scandidact NS-802
Magnesium sulfate heptahydrate Merck M5921 For SIF buffer
Microcenrifuge tubes + lids/caps VWR 700-5239
Mini Hacksaw BAHCO 208
O2 Strandmøllen 4.5 For carbogen gassing of SIF
Pentobarbital Glostrup pharmacy NA Magistral formula
Plastic containers ThermoFisher Scientific 536455
Plate photometer – Infinite M200 Tecan NA Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan.
Software: SW Magellan v.6.3
Potassium chloride Merck P9333 For SIF buffer
Scissor Allgaier Instruments 307-156-170
Small scissor Allgaier Instruments 04-520-115
Sodium bicarbonate Merck S6014 For SIF buffer
Sodium chloride Merck S9888 For SIF buffer
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 1.06346.1000 For SIF buffer
Sodium gluconate Merck S2054 For SIF buffer
Spatula Bochem Lab Supply 3018
Spring scissor Fine Science Tools 15024-10
Sucrose Merck 84097 For SIF buffer
Supercinnamaldehyde Merck S3322
Tulle (fabrics) NA NA Bought in the local fabrics store
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
  3. Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6 (2019).
  4. Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
  5. Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
  6. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies – successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338 (2018).
  7. Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
  8. Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
  9. Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
  10. Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
  11. Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
  12. Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
  13. Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
  14. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
  15. Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
  16. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
  17. Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
  18. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  19. Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
  20. Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
  21. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
  22. Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
  23. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  24. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
  25. Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
  26. Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
  27. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  28. Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
  29. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  30. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112 (2011).
  31. Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
  32. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  33. Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
  34. Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
  35. Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
  36. Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
  37. Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
  38. Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
  39. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  40. Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
  41. Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
  42. Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, 579-588 (1999).
  43. Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
  44. Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
  45. Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
  46. Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
  47. Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
  48. Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
  49. Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
  50. Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
  51. Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
  52. Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336 (2012).
  53. Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
  54. Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
  55. Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
  56. Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
  57. Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
  58. Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
  59. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  60. Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55 (2011).
  61. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  62. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  63. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  64. Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
  65. Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
  66. Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
  67. Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
  68. Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
  69. Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
  70. Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).

Tags

Ex VivoCalcitonin Gene-related PeptideTrigeminovascular SystemRodentsTrigeminal Vascular SystemCGRP ReleaseTrigeminal NerveTrigeminal GanglionTrigeminal Nucleus CaudalisBrain DissectionBrainstemCerebellumCranium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., Kristensen, D. M., Christensen, S. L. Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents. J. Vis. Exp. (183), e63723, doi:10.3791/63723 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image