Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas

El fenómeno de dispersión Raman fue observado por primera vez en 1928 por C. V. Raman¹. Cuando un fotón incidente está interactuando con una muestra, puede ocurrir espontáneamente un evento de dispersión inelástica, en el que el cambio de energía del fotón coincide con una transición vibratoria de la especie química analizada. Este proceso no requiere el uso de una etiqueta química, por lo que es una herramienta versátil y sin etiquetas para el análisis químico al tiempo que minimiza la perturbación de la muestra. A pesar de sus ventajas, la dispersión Raman espontánea sufre de una sección transversal de dispersión baja (típicamente 10¹¹ más baja que la sección transversal de absorción infrarroja [IR]), lo que requiere largos tiempos de adquisición para el análisis². Por lo tanto, la búsqueda de aumentar la sensibilidad del proceso de dispersión Raman es esencial para impulsar las tecnologías Raman para obtener imágenes en tiempo real.

Una forma efectiva de mejorar en gran medida la sensibilidad de la dispersión Raman es a través de procesos coherentes de dispersión Raman (CRS), para los cuales generalmente se utilizan dos pulsos láser para excitar transiciones vibracionales moleculares ^3,4. Cuando la diferencia de energía de fotones entre los dos láseres coincide con los modos vibratorios de las moléculas de muestra, se generarán fuertes señales Raman. Los dos procesos CRS más utilizados para la obtención de imágenes son la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) y la dispersión Raman estimulada (SRS)⁵. En las últimas dos décadas, los desarrollos tecnológicos han avanzado las técnicas de microscopía CARS y SRS para convertirse en herramientas poderosas para la cuantificación y elucidación sin etiquetas de los cambios químicos en muestras biológicas.

Las imágenes químicas por microscopía CARS se pueden fechar en 1982, cuando el escaneo láser se aplicó por primera vez para adquirir imágenes CARS, demostrado por Duncan et al⁶. La modernización de la microscopía CARS se aceleró enormemente después de las amplias aplicaciones de la microscopía de fluorescencia multifotónica de barrido láser⁷. Los primeros trabajos del grupo Xie utilizando láseres de alta tasa de repetición han hecho que CARS sea una plataforma de imágenes químicas de alta velocidad, sin etiquetas, para la caracterización de moléculas en muestras biológicas ^8,9,10. Uno de los principales problemas para las imágenes CARS es la presencia de un fondo no resonante, lo que reduce el contraste de la imagen y distorsiona el espectro Raman. Se han hecho muchos esfuerzos para reducir el fondo no resonante 11,12,13,14,15 o para extraer señales Raman resonantes de los espectros CARS ^16,17. Otro avance que ha avanzado mucho en el campo es la imagen hiperespectral CARS, que permite el mapeo espectral en cada píxel de imagen con una selectividad química mejorada 18,19,20,21.

La dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imagen más joven que CARS, aunque se descubrió antes²². En 2007, se informó de microscopía SRS utilizando una fuente láser de baja tasa de repetición²³. Pronto, varios grupos demostraron imágenes SRS de alta velocidad utilizando láseres de alta tasa de repetición 24,25,26. Una de las principales ventajas de la microscopía SRS sobre CARS es la ausencia del fondo no resonante²⁷, aunque otros fondos como la modulación de fase cruzada (XPM), la absorción transitoria (TA), la absorción de dos fotones (TPA) y el efecto fototérmico (PT), pueden ocurrir con SRS²⁸. Además, la señal SRS y la concentración de la muestra tienen relaciones lineales, a diferencia de CARS, que tiene una dependencia cuadrática de concentración de señal²⁹. Esto simplifica la cuantificación química y la desmezcla espectral. El SRS multicolor e hiperespectral ha evolucionado en diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, siendo el enfoque espectral uno de los enfoques más populares para la obtención de imágenes químicas ^37,38.

Tanto CARS como SRS requieren el enfoque de la bomba y los rayos láser Stokes en la muestra para que coincida con la transición vibratoria de las moléculas para la excitación de la señal. Los microscopios CARS y SRS también comparten mucho en común. Sin embargo, la física subyacente a estos dos procesos, y las detecciones de señales involucradas en estas tecnologías de microscopía tienen disparidades ^3,39. CARS es un proceso paramétrico que no tiene acoplamiento neto de energía fotón-molécula³. SRS, sin embargo, es un proceso no paramétrico, y contribuye a la transferencia de energía entre fotones y sistemas moleculares²⁷. En CARS, se genera una nueva señal a frecuencia anti-Stokes, mientras que SRS se manifiesta como la transferencia de energía entre la bomba y los rayos láser stokes.

La señal CARS satisface Eq (1)²⁸.

(1)

Mientras tanto, la señal SRS se puede escribir como Eq (2)²⁸.

(2)

Aquí, I_p, I_s, I_CARS y ΔI_SRS son las intensidades del haz de la bomba, el haz de Stokes, la señal CARS y las señales SRS, respectivamente. χ⁽³⁾ es la susceptibilidad óptica no lineal de tercer orden de la muestra, y es un valor complejo compuesto de partes reales e imaginarias.

Estas ecuaciones expresan los perfiles espectrales y la dependencia de la concentración de señal de CARS y SRS. Las diferencias en la física dan como resultado esquemas de detección dispares para estas dos tecnologías de microscopía. La detección de señales en CARS generalmente implica la separación espectral de fotones recién generados y la detección utilizando un tubo fotomultiplicador (PMT) o un dispositivo de carga acoplada (CCD); para SRS, el intercambio de energía entre la bomba y los haces de Stokes generalmente se mide mediante modulación de intensidad de alta velocidad utilizando un modulador óptico y demodulación utilizando un fotodiodo (PD) emparejado con un amplificador de bloqueo.

Aunque en los últimos años se han publicado muchos desarrollos y aplicaciones tecnológicas en los campos CARS y SRS, no se han realizado comparaciones sistemáticas de las dos técnicas CRS en la misma plataforma, especialmente para CARS hiperespectrales y microscopía SRS. Las comparaciones directas en sensibilidad, resolución espacial, resolución espectral y capacidades de separación química permitirían a los biólogos seleccionar la mejor modalidad para la cuantificación química. En este protocolo, se proporcionan pasos detallados para construir una plataforma de imágenes multimodales con modalidades hiperespectrales CARS y SRS basadas en un sistema láser de femtosegundo y enfoque espectral. Las dos técnicas se han comparado en la dirección hacia adelante para la resolución espectral, la sensibilidad de detección, la resolución espacial y los contrastes de imágenes de las células.