Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Het Raman-verstrooiingsfenomeen werd voor het eerst waargenomen in 1928 door C. V. Raman¹. Wanneer een invallend foton interageert met een monster, kan spontaan een inelastische verstrooiingsgebeurtenis optreden, waarbij de energieverandering van het foton overeenkomt met een vibrationele overgang van de geanalyseerde chemische soort. Dit proces vereist geen gebruik van een chemische tag, waardoor het een veelzijdig, labelvrij hulpmiddel is voor chemische analyse en tegelijkertijd de verstoring van monsters minimaliseert. Ondanks de voordelen lijdt spontane Raman-verstrooiing aan een lage verstrooiingsdoorsnede (meestal 10¹¹ lager dan de infrarood [IR] absorptiedoorsnede), wat lange acquisitietijden vereist voor analyse². De zoektocht naar het verhogen van de gevoeligheid van het Raman-verstrooiingsproces is dus essentieel bij het pushen van Raman-technologieën voor realtime beeldvorming.

Een effectieve manier om de gevoeligheid van Raman-verstrooiing aanzienlijk te verbeteren, is door middel van coherente Raman-verstrooiingsprocessen (CRS), waarvoor meestal twee laserpulsen worden gebruikt om moleculaire trillingsovergangen te exciteren ^3,4. Wanneer het fotonenergieverschil tussen de twee lasers overeenkomt met de trillingsmodi van monstermoleculen, worden sterke Raman-signalen gegenereerd. De twee meest gebruikte CRS-processen voor beeldvorming zijn coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) en gestimuleerde Raman scattering (SRS)⁵. In de afgelopen twee decennia hebben technologische ontwikkelingen CARS- en SRS-microscopietechnieken verbeterd om krachtige hulpmiddelen te worden voor labelvrije kwantificering en opheldering van chemische veranderingen in biologische monsters.

Chemische beeldvorming door CARS-microscopie kan worden gedateerd op 1982 toen laserscanning voor het eerst werd toegepast om CARS-beelden te verkrijgen, gedemonstreerd door Duncan et al⁶. De modernisering van CARS-microscopie werd sterk versneld na de brede toepassingen van laserscanning multifotonenfluorescentiemicroscopie⁷. Vroeg werk van de Xie-groep met behulp van lasers met een hoge herhalingssnelheid heeft CARS omgevormd tot een snel, labelvrij, chemisch beeldvormingsplatform voor de karakterisering van moleculen in biologische monsters ^8,9,10. Een van de belangrijkste problemen voor CARS-beeldvorming is de aanwezigheid van een niet-resonante achtergrond, die het beeldcontrast vermindert en het Raman-spectrum vervormt. Er zijn veel inspanningen geleverd om ofwel de niet-resonante achtergrond^{11,12,13,14,15} te verminderen of om resonante Raman-signalen uit de CARS-spectra^16,17 te ^halen. Een andere vooruitgang die het veld enorm heeft verbeterd, is hyperspectrale CARS-beeldvorming, die spectrale mapping mogelijk maakt bij elke beeldpixel met verbeterde chemische selectiviteit 18,19,20,21.

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) is een jongere beeldvormingstechnologie dan CARS, hoewel het eerder werd ontdekt²². In 2007 werd SRS-microscopie gerapporteerd met behulp van een laserbron met lage herhalingssnelheid²³. Al snel demonstreerden verschillende groepen high-speed SRS-beeldvorming met behulp van lasers met hoge herhalingssnelheid 24,25,26. Een van de belangrijkste voordelen van SRS-microscopie ten opzichte van CARS is de afwezigheid van de niet-resonante achtergrond²⁷, hoewel andere achtergronden zoals cross-phase modulatie (XPM), transiënte absorptie (TA), twee-fotonenabsorptie (TPA) en fotothermisch (PT) effect, kunnen optreden met SRS²⁸. Bovendien hebben het SRS-signaal en de monsterconcentratie lineaire relaties, in tegenstelling tot CARS, dat een kwadratische signaalconcentratieafhankelijkheid heeft²⁹. Dit vereenvoudigt chemische kwantificering en spectrale ontmenging. Multicolor en hyperspectrale SRS is geëvolueerd in verschillende vormen 30,31,32,33,34,35,36, waarbij spectrale focus een van de meest populaire benaderingen is voor chemische beeldvorming ^37,38.

Zowel CARS als SRS vereisen de focus van de pomp en Stokes laserstralen op het monster om de trillingsovergang van de moleculen voor signaalexcitatie te matchen. CARS en SRS microscopen hebben ook veel gemeen. De fysica die ten grondslag ligt aan deze twee processen en signaaldetecties die betrokken zijn bij deze microscopietechnologieën hebben echter verschillen ^3,39. CARS is een parametrisch proces dat geen netto foton-molecuul energiekoppeling^{heeft 3}. SRS is echter een niet-parametrisch proces en draagt bij aan de energieoverdracht tussen fotonen en moleculaire systemen²⁷. In CARS wordt een nieuw signaal met anti-Stokes-frequentie gegenereerd, terwijl SRS zich manifesteert als de energieoverdracht tussen de pomp en Stokes-laserstralen.

CARS-signaal voldoet aan Eq (1)²⁸.

(1)

Ondertussen kan het SRS-signaal worden geschreven als Eq (2) ²⁸.

(2)

Hier zijn I_p, I_s, I_CARS en ΔI_SRS de intensiteiten van respectievelijk de pompbundel, Stokes-bundel, CARS-signaal en SRS-signalen. χ⁽³⁾ is de derde-orde niet-lineaire optische gevoeligheid van het monster en is een complexe waarde die bestaat uit reële en imaginaire delen.

Deze vergelijkingen drukken de spectrale profielen en signaalconcentratieafhankelijkheid van CARS en SRS uit. Verschillen in fysica resulteren in ongelijksoortige detectieschema’s voor deze twee microscopietechnologieën. Signaaldetectie in CARS omvat meestal spectrale scheiding van nieuw gegenereerde fotonen en detectie met behulp van een fotomultiplicatorbuis (PMT) of charge-coupled device (CCD); voor SRS wordt de energie-uitwisseling tussen de pomp en stokesbundels meestal gemeten door intensiteitsmodulatie met hoge snelheid met behulp van een optische modulator en demodulatie met behulp van een fotodiode (PD) in combinatie met een lock-in versterker.

Hoewel er de afgelopen jaren veel technologische ontwikkelingen en toepassingen zijn gepubliceerd op zowel CARS- als SRS-gebieden, zijn er geen systematische vergelijkingen van de twee CRS-technieken op hetzelfde platform uitgevoerd, vooral voor hyperspectrale CARS- en SRS-microscopie. Directe vergelijkingen in gevoeligheid, ruimtelijke resolutie, spectrale resolutie en chemische scheidingsmogelijkheden zouden biologen in staat stellen om de beste modaliteit voor chemische kwantificering te selecteren. In dit protocol worden gedetailleerde stappen beschreven om een multimodaal beeldvormingsplatform te bouwen met zowel hyperspectrale CARS- als SRS-modaliteiten op basis van een femtosecondelasersysteem en spectrale focus. De twee technieken zijn vergeleken in de voorwaartse richting voor spectrale resolutie, detectiegevoeligheid, ruimtelijke resolutie en beeldcontrasten van cellen.