Confronto diretto tra lo scattering Raman stimolato iperspettrale e la microscopia a dispersione raman coerente anti-Stokes per l'imaging chimico

Il fenomeno dello scattering Raman fu osservato per la prima volta nel 1928 da C. V. Raman¹. Quando un fotone incidente interagisce con un campione, può verificarsi spontaneamente un evento di scattering anelastico, in cui il cambiamento di energia del fotone corrisponde a una transizione vibrazionale delle specie chimiche analizzate. Questo processo non richiede l’uso di un tag chimico, rendendolo uno strumento versatile e privo di etichette per l’analisi chimica riducendo al minimo le perturbazioni del campione. Nonostante i suoi vantaggi, lo scattering Raman spontaneo soffre di una bassa sezione trasversale di scattering (tipicamente 10¹¹ inferiore alla sezione trasversale di assorbimento a infrarossi [IR]), che richiede lunghi tempi di acquisizione per l’analisi². Pertanto, la ricerca di aumentare la sensibilità del processo di scattering Raman è essenziale per spingere le tecnologie Raman per l’imaging in tempo reale.

Un modo efficace per migliorare notevolmente la sensibilità dello scattering Raman è attraverso processi di scattering Raman coerenti (CRS), per i quali due impulsi laser sono tipicamente utilizzati per eccitare le transizioni vibrazionali molecolari ^3,4. Quando la differenza di energia fotonica tra i due laser corrisponde alle modalità vibrazionali delle molecole campione, verranno generati forti segnali Raman. I due processi CRS più comunemente usati per l’imaging sono lo scattering raman anti-Stokes coerente (CARS) e lo scattering Raman stimolato (SRS)⁵. Negli ultimi due decenni, gli sviluppi tecnologici hanno avanzato le tecniche di microscopia CARS e SRS per diventare potenti strumenti per la quantificazione senza etichette e la delucidazione dei cambiamenti chimici nei campioni biologici.

L’imaging chimico mediante microscopia CARS può essere datato al 1982, quando la scansione laser è stata applicata per la prima volta per acquisire immagini CARS, dimostrata da Duncan et al⁶. La modernizzazione della microscopia CARS è stata notevolmente accelerata dopo le ampie applicazioni della microscopia a fluorescenza multifotone a scansione laser⁷. I primi lavori del gruppo Xie che utilizzano laser ad alto tasso di ripetizione hanno trasformato CARS in una piattaforma di imaging chimico ad alta velocità, priva di etichette, per la caratterizzazione di molecole in campioni biologici ^8,9,10. Uno dei principali problemi per l’imaging CARS è la presenza di uno sfondo non consonante, che riduce il contrasto dell’immagine e distorce lo spettro Raman. Sono stati fatti molti sforzi per ridurre lo sfondo non consonante 11,12,13,14,15 o per estrarre segnali Raman risonanti dagli spettri CARS ^16,17. Un altro progresso che ha notevolmente migliorato il campo è l’imaging CARS iperspettrale, che consente la mappatura spettrale di ogni pixel dell’immagine con una migliore selettività chimica 18,19,20,21.

Lo scattering Raman stimolato (SRS) è una tecnologia di imaging più giovane di CARS, sebbene sia stata scoperta prima del²². Nel 2007, la microscopia SRS è stata segnalata utilizzando una sorgente laser a basso tasso di ripetizione²³. Ben presto, diversi gruppi hanno dimostrato l’imaging SRS ad alta velocità utilizzando laser ad alto tasso di ripetizione 24,25,26. Uno dei principali vantaggi della microscopia SRS rispetto a CARS è l’assenza dello sfondo non consonante²⁷, sebbene altri sfondi come la modulazione multifase (XPM), l’assorbimento transitorio (TA), l’assorbimento a due fotoni (TPA) e l’effetto fototermico (PT), possano verificarsi con SRS²⁸. Inoltre, il segnale SRS e la concentrazione del campione hanno relazioni lineari, a differenza di CARS, che ha una dipendenza quadratica segnale-concentrazione²⁹. Ciò semplifica la quantificazione chimica e l’unmixing spettrale. L’SRS multicolore e iperspettrale si è evoluto in diverse forme ^{30,31,32,33,34,35,36}, con la messa a fuoco spettrale che è uno degli approcci più popolari per l’imaging chimico ^37,38.

Sia CARS che SRS richiedono la messa a fuoco della pompa e dei raggi laser Stokes sul campione per abbinare la transizione vibrazionale delle molecole per l’eccitazione del segnale. Anche i microscopi CARS e SRS hanno molto in comune. Tuttavia, la fisica alla base di questi due processi e le rilevazioni di segnali coinvolte in queste tecnologie di microscopia hanno disparità ^3,39. CARS è un processo parametrico che non ha un accoppiamento netto di energia fotone-molecola³. SRS, tuttavia, è un processo non parametrico e contribuisce al trasferimento di energia tra fotoni e sistemi molecolari²⁷. In CARS, viene generato un nuovo segnale alla frequenza anti-Stokes, mentre SRS si manifesta come il trasferimento di energia tra la pompa e i raggi laser Stokes.

Il segnale CARS soddisfa Eq (1)²⁸.

(1)

Nel frattempo, il segnale SRS può essere scritto come Eq (2)²⁸.

(2)

Qui, I_p, I_s, I_CARS e ΔI_SRS sono rispettivamente le intensità del fascio della pompa, del fascio di Stokes, del segnale CARS e dei segnali SRS. χ⁽³⁾ è la suscettibilità ottica non lineare del terzo ordine del campione ed è un valore complesso composto da parti reali e immaginarie.

Queste equazioni esprimono i profili spettrali e la dipendenza dalla concentrazione del segnale di CARS e SRS. Le differenze nella fisica si traducono in schemi di rilevamento disparati per queste due tecnologie di microscopia. Il rilevamento del segnale in CARS di solito comporta la separazione spettrale di fotoni di nuova generazione e il rilevamento utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD); per SRS, lo scambio di energia tra la pompa e i fasci di Stokes viene solitamente misurato mediante modulazione di intensità ad alta velocità utilizzando un modulatore ottico e demodulazione utilizzando un fotodiodo (PD) abbinato a un amplificatore lock-in.

Sebbene molti sviluppi tecnologici e applicazioni siano stati pubblicati negli ultimi anni sia in ambito CARS che SRS, non sono stati eseguiti confronti sistematici delle due tecniche CRS sulla stessa piattaforma, in particolare per la microscopia iperspettrale CARS e SRS. Confronti diretti in sensibilità, risoluzione spaziale, risoluzione spettrale e capacità di separazione chimica consentirebbero ai biologi di selezionare la migliore modalità per la quantificazione chimica. In questo protocollo, vengono forniti passaggi dettagliati per costruire una piattaforma di imaging multimodale con entrambe le modalità CARS iperspettrale e SRS basate su un sistema laser a femtosecondi e messa a fuoco spettrale. Le due tecniche sono state confrontate in avanti per la risoluzione spettrale, la sensibilità di rilevamento, la risoluzione spaziale e i contrasti di imaging delle cellule.