Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

O fenômeno de dispersão de Raman foi observado pela primeira vez em 1928 por C. V. Raman¹. Quando um fóton incidente está interagindo com uma amostra, um evento de dispersão inelástica pode ocorrer espontaneamente, no qual a mudança de energia do fóton corresponde a uma transição vibracional das espécies químicas analisadas. Este processo não requer o uso de uma etiqueta química, tornando-a uma ferramenta versátil e livre de rótulos para análise química, minimizando a perturbação da amostra. Apesar de suas vantagens, a dispersão espontânea de Raman sofre de uma seção transversal de baixa dispersão (tipicamente 10¹¹ menor que a seção transversal de absorção infravermelha [IR]), o que requer longos tempos de aquisição para análise². Assim, a busca pelo aumento da sensibilidade do processo de dispersão de Raman é essencial para impulsionar as tecnologias Raman para imagens em tempo real.

Uma maneira eficaz de aumentar muito a sensibilidade da dispersão de Raman é através de processos coerentes de dispersão de Raman (CRS), para os quais dois pulsos de laser são tipicamente usados para excitar transições vibracionais moleculares ^3,4. Quando a diferença de energia de fótons entre os dois lasers corresponde aos modos vibracionais das moléculas de amostra, fortes sinais raman serão gerados. Os dois processos de CRS mais usados para imagem são a dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) e a dispersão de Raman estimulada (SRS)⁵. Nas últimas duas décadas, os desenvolvimentos tecnológicos avançaram nas técnicas de microscopia de CARROS e SRS para se tornarem ferramentas poderosas para quantificação sem rótulos e elucidação de alterações químicas em amostras biológicas.

A imagem química por microscopia CARS pode ser datada de 1982 quando a varredura a laser foi aplicada pela primeira vez para adquirir imagens CARS, demonstradas por Duncan et al⁶. A modernização da microscopia CARS foi bastante acelerada após as amplas aplicações da microscopia de fluorescência multifoton^{a laser 7}. Os primeiros trabalhos do grupo Xie usando lasers de alta taxa de repetição tornaram-se uma plataforma de imagem química de alta velocidade, sem rótulos, para a caracterização de moléculas em amostras biológicas ^8,9,10. Um dos principais problemas para a imagem cars é a presença de um fundo não ressonante, que reduz o contraste da imagem e distorce o espectro Raman. Muitos esforços foram feitos para reduzir o fundo não ressonante 11,12,13,14,15 ou para extrair sinais raman ressonantes do espectro ^{CARS 16,17}. Outro avanço que tem avançado muito o campo é a imagem de CARS hiperespectral, que permite o mapeamento espectral em cada pixel de imagem com melhor seletividade química 18,19,20,21.

A dispersão de Raman Estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem mais jovem do que cars, embora tenha sido descoberta anteriormente^{aos 22 anos}. Em 2007, a microscopia SRS foi relatada usando uma baixa taxa de repetição da fonte laser²³. Logo, vários grupos demonstraram imagens de SRS de alta velocidade usando lasers de alta taxa de repetição 24,25,26. Uma das principais vantagens da microscopia SRS sobre carros é a ausência do fundo não ressonante²⁷, embora outros fundos como modulação transversal (XPM), absorção transitória (TA), absorção de dois fótons (TPA) e efeito fototermal (PT), possam ocorrer com o SRS²⁸. Além disso, o sinal SRS e a concentração amostral têm relações lineares, ao contrário dos CARS, que tem uma dependência quadrática de concentração de sinal²⁹. Isso simplifica a quantificação química e o descompramento espectral. A SRS multicolorida e hiperespectral evoluiu de diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, com foco espectral sendo uma das abordagens mais populares para a imagem química ^37,38.

Tanto os CARROS quanto o SRS requerem o foco da bomba e os raios laser de Stokes na amostra para combinar com a transição vibracional das moléculas para excitação de sinal. Os microscópios CARS e SRS também compartilham muito em comum. No entanto, a física subjacente a esses dois processos, e as detecções de sinais envolvidas nessas tecnologias de microscopia têm disparidades ^3,39. CARS é um processo paramétrico que não tem acoplamento de energia net fóton-molécula³. O SRS, no entanto, é um processo não paramétrico, e contribui para a transferência de energia entre fótons e sistemas moleculares²⁷. Em CARS, um novo sinal na frequência anti-Stokes é gerado, enquanto o SRS se manifesta como a transferência de energia entre a bomba e os raios laser stokes.

O sinal CARS satisfaz eq (1)²⁸.

(1)

Enquanto isso, o sinal SRS pode ser escrito como Eq (2)²⁸.

(2)

Aqui, eu_p, i_s, I_CARS, e ΔI_SRS são as intensidades do feixe de bomba, feixe de Stokes, sinal CARS e sinais SRS, respectivamente. Χ⁽³⁾ é a suscetibilidade óptica não linear de terceira ordem da amostra, e é um valor complexo composto de partes reais e imaginárias.

Essas equações expressam os perfis espectrais e a dependência de concentração de sinais de CARROS e SRS. Diferenças na física resultam em esquemas de detecção diferentes para essas duas tecnologias de microscopia. A detecção de sinal em CARROS geralmente envolve a separação espectral de fótons recém-gerados e a detecção usando um tubo fotomultiplier (PMT) ou dispositivo acoplado por carga (CCD); para SRS, a troca de energia entre a bomba e os feixes de Stokes é geralmente medida pela modulação de alta velocidade de intensidade usando um modulador óptico e desmodulação usando um fotodiodo (PD) emparelhado com um amplificador de travamento.

Embora muitos desenvolvimentos tecnológicos e aplicações tenham sido publicados nos últimos anos nos campos de CARROS e SRS, não foram realizadas comparações sistemáticas das duas técnicas de CRS na mesma plataforma, especialmente para carros hiperespectrais e microscopia SRS. Comparações diretas em sensibilidade, resolução espacial, resolução espectral e capacidades de separação química permitiriam aos biólogos selecionar a melhor modalidade de quantificação química. Neste protocolo, são fornecidas etapas detalhadas para a construção de uma plataforma de imagem multimodal com as modalidades CARROS hiperespectrais e SRS baseadas em um sistema laser femtosegundo e foco espectral. As duas técnicas foram comparadas na direção para resolução espectral, sensibilidade à detecção, resolução espacial e contrastes de imagem das células.