השוואה ישירה של פיזור ראמן מגורה היפרספקטרלי ומיקרוסקופיית פיזור ראמן אנטי-סטוקס קוהרנטית להדמיה כימית

תופעת פיזור הרמאן נצפתה לראשונה בשנת 1928 על ידי C. V. Raman¹. כאשר פוטון אירוע מקיים אינטראקציה עם דגימה, אירוע פיזור לא אלסטי יכול להתרחש באופן ספונטני, שבו שינוי האנרגיה של הפוטון תואם מעבר רטטי של המין הכימי שנותח. תהליך זה אינו דורש שימוש בתג כימי, מה שהופך אותו לכלי רב-תכליתי ונטול תוויות לניתוח כימי תוך מזעור ההפרעה לדגימות. למרות יתרונותיו, פיזור ראמן ספונטני סובל מחתך פיזור נמוך (בדרך כלל 10¹¹ נמוך יותר מחתך הקליטה האינפרא אדום [IR]), המחייב זמני רכישה ארוכים לניתוח². לפיכך, השאיפה להגברת הרגישות של תהליך פיזור הראמן חיונית לדחיפת טכנולוגיות ראמאן להדמיה בזמן אמת.

אחת הדרכים היעילות להגביר במידה ניכרת את הרגישות של פיזור ראמאן היא באמצעות תהליכי פיזור ראמאן (CRS) קוהרנטיים, שעבורם שני פעימות לייזר משמשות בדרך כלל להנעת מעברי רטט מולקולריים ^3,4. כאשר הפרש אנרגיית הפוטונים בין שני הלייזרים מתאים למצבי הרטט של מולקולות הדגימה, ייווצרו אותות ראמאן חזקים. שני תהליכי ה-CRS הנפוצים ביותר להדמיה הם פיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) ופיזור ראמאן מגורה (SRS)⁵. במהלך שני העשורים האחרונים, פיתוחים טכנולוגיים קידמו את טכניקות המיקרוסקופיה של CARS ו-SRS כדי להפוך לכלים רבי עוצמה לכימות ללא תוויות ולהבהרת שינויים כימיים בדגימות ביולוגיות.

הדמיה כימית על ידי מיקרוסקופיה של CARS יכולה להיות מתוארכת לשנת 1982 כאשר סריקת לייזר יושמה לראשונה כדי לרכוש תמונות CARS, שהודגמו על ידי Duncan et al⁶. המודרניזציה של מיקרוסקופיית CARS הואצה מאוד לאחר היישומים הרחבים של סריקת לייזר של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מולטי-פוטון⁷. עבודה מוקדמת של קבוצת Xie באמצעות לייזרים בקצב חזרות גבוה הפכה את CARS לפלטפורמת הדמיה כימית מהירה, נטולת תוויות, לאפיון מולקולות בדגימות ביולוגיות ^8,9,10. אחת הבעיות המרכזיות בהדמיית CARS היא נוכחותו של רקע לא-רזוננטי, מה שמפחית את ניגודיות התמונה ומעוות את ספקטרום הראמן. נעשו מאמצים רבים להפחית את הרקע הלא-רנסנטי ^{11,12,13,14,15} או לחלץ אותות ראמאן מהדהדים מהספקטרה ^16,17 של CARS. התקדמות נוספת שהקדמה מאוד את התחום היא הדמיית CARS היפרספקטרלית, המאפשרת מיפוי ספקטרלי בכל פיקסל תמונה עם סלקטיביות כימית משופרת 18,19,20,21.

פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכנולוגיית הדמיה צעירה יותר מ-CARS, אם כי היא התגלתה מוקדם יותר^{בשנת 22}. בשנת 2007 דווח על מיקרוסקופיית SRS באמצעות מקור לייזר בעל קצב חזרות נמוך²³. עד מהרה, מספר קבוצות הדגימו הדמיית SRS במהירות גבוהה באמצעות לייזרים בקצב חזרת גבוה 24,25,26. אחד היתרונות העיקריים של מיקרוסקופיית SRS על פני CARS הוא היעדר הרקע הלא-רציוננטי²⁷, אם כי רקעים אחרים כגון אפנון חוצה פאזות (XPM), קליטה חולפת (TA), בליעת שני פוטונים (TPA) ואפקט פוטוסתרמי (PT), עשויים להתרחש עם SRS²⁸. בנוסף, לאות SRS ולריכוז הדגימה יש קשרים ליניאריים, בניגוד ל-CARS, שיש לה תלות ריבועית בריכוז האות²⁹. זה מפשט את הכימות הכימי ואת אי-המיזוג הספקטרלי. SRS צבעוני והיפרספקטרלי התפתח בצורות שונות 30,31,32,33,34,35,36, כאשר מיקוד ספקטרלי הוא אחת הגישות הפופולריות ביותר להדמיה כימית ^37,38.

גם CARS וגם SRS דורשים את המיקוד של המשאבה ואת קרני הלייזר של סטוקס על הדגימה כדי להתאים למעבר הרטט של המולקולות לעירור אותות. מכוניות ומיקרוסקופים SRS גם חולקים הרבה במשותף. עם זאת, בפיזיקה העומדת בבסיס שני התהליכים הללו, ובזיהוי האותות המעורבים בטכנולוגיות מיקרוסקופיה אלה, יש פערים^{של 3,39}. CARS הוא תהליך פרמטרי שאין לו צימוד אנרגיה נטו של פוטון-מולקולה³. SRS, לעומת זאת, הוא תהליך לא-פאראמטרי, ותורם להעברת אנרגיה בין פוטונים למערכות מולקולריות²⁷. ב-CARS נוצר אות חדש בתדר אנטי-סטוקס, בעוד ש-SRS מתבטא בהעברת האנרגיה בין המשאבה לקרני הלייזר של סטוקס.

אות CARS עונה על Eq (1)²⁸.

(1)

בינתיים, ניתן לכתוב אות SRS כ- Eq (2)²⁸.

(2)

כאן, I_p, I_s, I_CARS ו – ΔI_SRS הם העוצמות של אלומת המשאבה, קרן סטוקס, אות CARS ואותות SRS, בהתאמה. χ⁽³⁾ הוא הרגישות האופטית הלא-ליניארית מסדר שלישי של המדגם, והוא ערך מורכב המורכב מחלקים ממשיים ודמיוניים.

משוואות אלה מבטאות את הפרופילים הספקטרליים ואת התלות בריכוז האותות של CARS ו-SRS. הבדלים בפיזיקה גורמים לתוכניות זיהוי שונות עבור שתי טכנולוגיות מיקרוסקופיה אלה. זיהוי אותות ב-CARS כולל בדרך כלל הפרדה ספקטרלית של פוטונים חדשים שנוצרו וזיהוי באמצעות שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) או התקן מצומד מטען (CCD); עבור SRS, חילופי האנרגיה בין המשאבה לבין אלומות סטוקס נמדדים בדרך כלל על ידי אפנון בעוצמה גבוהה באמצעות אפנן אופטי ודמודולציה באמצעות פוטודיודה (PD) בשילוב עם מגבר נעילה.

למרות שהתפתחויות ויישומים טכנולוגיים רבים פורסמו בשנים האחרונות הן בתחום CARS והן בתחום ה- SRS, לא בוצעו השוואות שיטתיות של שתי טכניקות ה- CRS באותה פלטפורמה, במיוחד עבור מכוניות היפרספקטרליות ומיקרוסקופיה SRS. השוואות ישירות ברגישות, ברזולוציה מרחבית, ברזולוציה ספקטרלית וביכולות הפרדה כימית יאפשרו לביולוגים לבחור את המודל הטוב ביותר לכימות כימי. בפרוטוקול זה, מסופקים שלבים מפורטים לבניית פלטפורמת הדמיה רב-מודאלית עם הן מכוניות היפרספקטרליות והן אופני SRS המבוססים על מערכת לייזר femtosecond ומיקוד ספקטרלי. שתי הטכניקות הושוו בכיוון קדימה לרזולוציה ספקטרלית, רגישות לזיהוי, רזולוציה מרחבית וניגודים הדמיה של תאים.