Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus
Summary
Se utilizaron cuatro métodos para detectar Wolbachia intracelular, que se complementaron entre sí y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de Aa23 derivada de Aedes albopictus y Aa23-T curada de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos.
Abstract
Como endosimbionte albergado maternalmente, Wolbachia infecta grandes proporciones de poblaciones de insectos. Los estudios han informado recientemente de la regulación exitosa de la transmisión del virus del ARN utilizando mosquitos transfectados por Wolbachia. Las estrategias clave para controlar los virus incluyen la manipulación de la reproducción del huésped a través de la incompatibilidad citoplasmática y la inhibición de las transcripciones virales a través del cebado inmune y la competencia por los recursos derivados del huésped. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de las respuestas de los mosquitos transfectados por Wolbachia a la infección viral son poco conocidos. Este artículo presenta un protocolo para la identificación in vitro de la infección por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína en las células Aa23 de Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) para mejorar la comprensión de las interacciones entre Wolbachia y sus insectos vectores. A través del uso combinado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa, el western blot y los métodos analíticos inmunológicos, se ha descrito un protocolo morfológico estándar para la detección de células infectadas por Wolbachia que es más preciso que el uso de un solo método. Este enfoque también se puede aplicar a la detección de la infección por Wolbachia en otros taxones de insectos.
Introduction
El mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que es un vector clave del virus del dengue (DENV) en Asia y otras partes del mundo1, es un huésped natural de dos tipos de bacterias intracelulares, Wolbachia (wAlbA y wAlbB), que se distribuyen por toda la línea germinal y el tejido somático 2,3. La línea celular Aa23 derivada de embriones de A. albopictus consta de al menos dos tipos de células morfológicas, las cuales apoyan la infección4 y pueden curarse de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos (Aa23-T). Dado que Aa23 conserva sólo wAlbB, es un modelo útil para el estudio de las interacciones huésped-endosimbionte 4,5,6.
Wolbachia es de transmisión materna e infecta aproximadamente el 65% de las especies de insectos 8,9 y el 28% de las especies de mosquitos10. Infecta una variedad de tejidos y forma una relación simbiótica íntima con el huésped, generalmente induciendo incompatibilidad citoplasmática (IC)11 y reemplazo poblacional mediante la manipulación del sistema reproductivo huésped12,13. Estas respuestas del huésped se han observado en poblaciones naturales de Drosophila simulans14 y en A. aegypti en una jaula de laboratorio y ensayo de campo15. Una importante manipulación no reproductiva provocada por Wolbachia es la resistencia inducida del huésped a una variedad de patógenos, incluidos el DENV, el virus Chikungunya (CHIKV) y el virus del Nilo Occidental (WNV)16,17, que puede estar mediado por un sistema inmune innato mejorado del simbionte18,19, la competencia entre Wolbachia y los virus por los recursos esenciales del huésped20 y la manipulación de las vías de defensa viral del huésped21 .
Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar estos mecanismos subyacentes de las respuestas antivirales del huésped inducidas por Wolbachia. Utiliza cuatro métodos de detección de la infección intracelular por Wolbachia de células Aa23. Estos métodos proporcionan una sólida base teórica para los estudios de la infección intracelular por Wolbachia de otras especies huésped. El primer método, la PCR, una técnica poderosa que permite la amplificación enzimática de regiones específicas de ADN sin utilizar procedimientos de clonación convencionales, se utilizó para detectar adn de Wolbachia y determinar la presencia/ausencia de infección por Wolbachia 22. El segundo método mide la densidad de copia de ADN de Wolbachia utilizando PCR cuantitativa (qPCR) para una detección y medición confiables de los productos generados durante cada ciclo de PCR que es directamente proporcional a la cantidad de plantilla antes de la PCR23. El tercer método detecta la presencia de proteínas Wolbachia intracelulares, utilizando Western Blot, una de las herramientas más poderosas para detectar proteínas específicas en mezclas complejas mediante la combinación del alto poder de separación de la electroforesis, la especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de las reacciones enzimáticas cromogénicas. El método final es un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) que combina inmunología, bioquímica y microscopía para detectar la proteína de superficie wolbachia (wsp) a través de una reacción antígeno-anticuerpo para confirmar la absorción celular de Wolbachia y determinar su localización celular.
Este artículo describe los cuatro métodos enumerados anteriormente para verificar la existencia de Wolbachia en las células, que se pueden utilizar para detectar si la Wolbachia exógena se transfectó con éxito y la Wolbachia en la célula se eliminó. Después de determinar si Wolbachia está presente en las células o no, se puede realizar una variedad de análisis diferentes, incluyendo genómica, proteómica o metabolómica. Este protocolo demuestra la detección de Wolbachia a través de células Aa23, pero también se puede utilizar en otras células.
Protocol
Representative Results
Discussion
La detección de la infección intracelular por Wolbachia es esencial para el estudio de las interacciones Wolbachia-huésped y la confirmación de la transfección exitosa de células con nuevas cepas. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína. Estos cuatro métodos experimentales corroboraron y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las cél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Xin-Ru Wang de la Universidad de Minnesota por sus perspicaces sugerencias y orientación. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O’Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
- Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
- O’Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
- Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
- Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
- Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology – Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
- Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
- Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
- Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O’Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
- O’Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. . Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
- Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
- Zhang, G., Hussain, M., O’Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
- Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
- Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
- Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
- Zhou, W., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
- Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
- Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
- Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
- Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).
