Обнаружение штамма Wolbachia wAlbB в клеточных линиях Aedes albopictus
Summary
Для выявления внутриклеточной вольбахии использовались четыре метода, которые дополняли друг друга и повышали точность обнаружения инфекции Wolbachia Aedes albopictus Aa23 и Aa23-T, вылеченной от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков.
Abstract
Как материнский эндосимбионт, Wolbachia заражает большую часть популяций насекомых. Недавно в исследованиях сообщалось об успешной регуляции передачи РНК-вируса с использованием комаров, транс инфицированных Wolbachia. Ключевые стратегии борьбы с вирусами включают манипулирование размножением хозяина через цитоплазматическую несовместимость и ингибирование вирусных транскриптов посредством иммунного прайминга и конкуренции за ресурсы, полученные от хозяина. Однако основные механизмы реакций комаров, транс инфицированных Вольбахией, на вирусную инфекцию плохо изучены. В этой статье представлен протокол идентификации in vitro инфекции Wolbachia на уровнях нуклеиновых кислот и белка в клетках Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 для улучшения понимания взаимодействий между Wolbachia и ее насекомыми-переносчиками. Благодаря комбинированному использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественной ПЦР, западного блоттинга и иммунологических аналитических методов был описан стандартный морфологический протокол для обнаружения клеток, инфицированных Вольбахией, который является более точным, чем использование одного метода. Этот подход также может быть применен к обнаружению инфекции Wolbachia у других таксонов насекомых.
Introduction
Азиатский тигровый комар Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), который является ключевым переносчиком вируса денге (DENV) в Азии и других частях мира1, является естественным хозяином двух типов внутриклеточных бактерий, Wolbachia (wAlbA и wAlbB), которые распределены по всей зародышевой линии и соматической ткани 2,3. Клеточная линия Aa23, полученная из эмбрионов A. albopictus, состоит, по меньшей мере, из двух морфологических типов клеток, оба из которых поддерживают инфекцию4 и могут быть излечены от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков (Aa23-T). Учитывая, что Aa23 сохраняет только wAlbB, это полезная модель для изучения взаимодействий хозяин-эндосимбионт 4,5,6.
Wolbachia передается через мать и заражает, по оценкам, 65% видов насекомых 8,9 и 28% видов комаров10. Он инфицирует различные ткани и формирует интимные симбиотические отношения с хозяином, обычно вызывая цитоплазматическую несовместимость (CI)11 и популяционную замену путем манипулирования репродуктивной системой хозяина12,13. Эти ответы хозяина наблюдались в естественных популяциях Drosophila simulans14 и у A. aegypti в лабораторной клетке и полевых испытаниях15. Важной нерепродуктивной манипуляцией, вызванной Вольбахией, является индуцированная устойчивость хозяина к различным патогенам, включая DENV, вирус чикунгуньи (CHIKV) и вирус Западного Нила (ВЗН)16,17, которые могут быть опосредованы улучшенной врожденной иммунной системой симбионта18,19, конкуренцией между Wolbachia и вирусами за основные ресурсы хозяина20 и манипулированием путями вирусной защиты хозяина21 .
Этот протокол был разработан для изучения этих основных механизмов противовирусных реакций хозяина, вызванных Вольбахией. В нем используются четыре метода выявления внутриклеточной вольбахской инфекции клеток Aa23. Эти методы обеспечивают прочную теоретическую основу для исследований внутриклеточной инфекции Wolbachia других видов хозяев. Первый метод, ПЦР – мощный метод, позволяющий ферментативную амплификацию определенных областей ДНК без использования обычных процедур клонирования – был использован для обнаружения ДНК Wolbachia и определения наличия /отсутствия инфекции Wolbachia 22. Второй метод измеряет плотность копий ДНК Wolbachia с использованием количественной ПЦР (qPCR) для надежного обнаружения и измерения продуктов, генерируемых во время каждого цикла ПЦР, что прямо пропорционально количеству шаблона до ПЦР23. Третий метод обнаруживает наличие внутриклеточных белков Wolbachia , используя западный блот — один из самых мощных инструментов для обнаружения специфических белков в сложных смесях путем сочетания высокой силы разделения электрофореза, специфичности антител и чувствительности хромогенных ферментативных реакций. Окончательным методом является иммунофлуоресцентный анализ (IFA), который сочетает иммунологию, биохимию и микроскопию для обнаружения поверхностного белка Wolbachia (wsp) через реакцию антиген-антитело для подтверждения клеточного поглощения Wolbachia и определения его клеточной локализации.
В этой статье описываются четыре метода, перечисленные выше для проверки существования Wolbachia в клетках, которые могут быть использованы для определения того, была ли экзогенная Wolbachia успешно трансфектирована и Wolbachia в клетке была очищена. После определения того, присутствует ли Вольбахия в клетках или нет, может быть выполнено множество различных анализов, включая геномику, протеомику или метаболомику. Этот протокол демонстрирует обнаружение Wolbachia через клетки Aa23, но также может быть использован в других клетках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обнаружение внутриклеточной инфекции Wolbachia имеет важное значение для изучения взаимодействий Wolbachia-host и подтверждения успешной трансфекции клеток с новыми штаммами. В этом протоколе были использованы четыре метода для успешного выявления внутриклеточной инфекции Wolbachia</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Синь-Ру Вана из Университета Миннесоты за проницательные предложения и рекомендации. Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O’Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
- Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
- O’Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
- Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
- Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
- Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology – Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
- Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
- Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
- Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O’Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
- O’Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. . Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
- Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
- Zhang, G., Hussain, M., O’Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
- Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
- Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
- Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
- Zhou, W., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
- Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
- Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
- Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
- Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).
