ヒトスジシマカ細胞株における ボルバキア 株 wAlbBの 検出
Summary
細胞内ボルバキアの検出には4つの方法を用い、抗生物質を用いた天然型ボルバキア感染症を治したヒトスジシマカ由来Aa23とAa23-Tのボルバキア感染の検出精度を向上させ、互いに補完し合いました。
Abstract
母体に抱かれている内共生生物として、ウォルバキアは昆虫集団の大部分に感染しています。研究は最近、ボルバキアトランスフェクトされた蚊を用いたRNAウイルス感染の成功した調節を報告している。ウイルスを制御するための重要な戦略には、細胞質非適合性を介した宿主再生の操作、免疫プライミングおよび宿主由来資源の競合によるウイルス転写産物の阻害が含まれる。しかし、ウイルス感染に対するボルバキアトランスフェクト蚊の応答の根底にあるメカニズムはほとんど理解されていない。この論文は、Aedes albopictus(双翅目:Culicidae)Aa23細胞における核酸およびタンパク質レベルでのボルバキア感染のin vitro同定のためのプロトコルを提示し、Wolbachiaとその昆虫ベクターとの間の相互作用の理解を深める。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、定量PCR、ウェスタンブロット、および免疫学的分析方法の併用により、単一の方法の使用よりも正確なWolbachia感染細胞の検出のための標準的な形態学的プロトコルが記載されている。このアプローチは、他の昆虫分類群におけるボルバキア感染の検出にも適用され得る。
Introduction
アジアおよび世界の他の地域におけるデング熱ウイルス(DENV)の重要なベクターであるアジアのトラ蚊Aedes albopictus(Skuse)(双翅目:Culicidae)1は、生殖細胞系および体細胞組織全体に分布する2種類の細胞内細菌、Wolbachia(wAlbAおよびwAlbB)の天然宿主である2,3。A. albopictus胚に由来するAa23細胞株は、少なくとも2つの形態学的細胞型からなり、いずれも感染4を支持し、抗生物質(Aa23−T)を用いて天然のボルバキア感染を治癒させることができる。Aa23がwAlbBのみを保持することを考えると、宿主-内共生相互作用4,5,6の研究に有用なモデルである。
Wolbachiaは母体に伝染し、昆虫種の推定65%、8,9、蚊種の28%に感染します10。それは様々な組織に感染し、宿主と密接な共生関係を形成し、通常は宿主生殖器系を操作することによって細胞質不適合(CI)11および集団置換を誘導する12、13。これらの宿主応答は、ショウジョウバエのシミュラン14の自然集団および実験室ケージおよび野外試験15のA. aegyptiにおいて観察されている。Wolbachiaによって惹起される重要な非生殖操作は、DENV、チクングニアウイルス(CHIKV)、および西ナイルウイルス(WNV)16、17を含む様々な病原体に対する宿主耐性を誘導することであり、それは共生生物の改良された自然免疫系18、19、必須宿主資源のためのボルバキアとウイルスとの間の競合20、および宿主ウイルス防御経路21の操作によって媒介され得る.
このプロトコルは、ボルバキア誘導宿主抗ウイルス応答のこれらの根底にあるメカニズムを研究するために開発された。これは、Aa23細胞の細胞内ボルバキア感染の検出の4つの方法を使用する。これらの方法は、他の宿主種の細胞内ボルバキア感染の研究のための強力な理論的基礎を提供する。最初の方法であるPCR(従来のクローニング手順を使用せずにDNAの特定の領域を酵素的に増幅することを可能にする強力な技術)を使用して、ボルバキアDNAを検出し、ボルバキア感染の有無を決定しました22。第2の方法は、定量PCR(qPCR)を使用してボルバキアDNAコピー密度を測定し、PCR23前の鋳型の量に正比例する各PCRサイクル中に生成された産物の信頼性の高い検出および測定を行う。第3の方法は、電気泳動の高い分離力、抗体の特異性、発色酵素反応の感度を組み合わせることにより、複雑な混合物中の特定のタンパク質を検出するための最も強力なツールの1つであるウェスタンブロットを使用して、細胞内Wolbachiaタンパク質の存在を検出します。最後の方法は、免疫学、生化学、顕微鏡を組み合わせた免疫蛍光アッセイ(IFA)で、抗原抗体反応によってボルバキア表面タンパク質(wsp)を検出し、ウォルバキアの細胞取り込みを確認し、その細胞局在を決定します。
この論文では、細胞内のボルバキアの存在を検証するために上記の4つの方法を説明し、外因性のボルバキアが正常にトランスフェクトされ、細胞内のボルバキアがクリアされたかどうかを検出するために使用できます。Wolbachiaが細胞に存在するかどうかを決定した後、ゲノミクス、プロテオミクス、またはメタボロミクスを含む様々な異なる分析を行うことができる。このプロトコルは、Aa23細胞を介したボルバキアの検出を実証するが、他の細胞でも使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞内ボルバキア感染の検出は、ボルバキアと宿主の相互作用の研究および新規株による細胞のトランスフェクションの成功の確認に不可欠である。このプロトコールでは、核酸およびタンパク質レベルで細胞内Wolbachia感染を首尾よく検出するために4つの方法が使用された。これら4つの実験方法は、細胞のボルバキア感染の検出精度を裏付け、改善した。
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ミネソタ大学のXin-Ru Wang博士の洞察に満ちた提案と指導に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(No.81760374)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
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