Aedes albopictus Hücre Hatlarında Wolbachia Suşu wAlbB'nin Tespiti
Summary
Hücre içi Wolbachia’yı tespit etmek için birbirini tamamlayan ve Aedes albopictus’tan türetilmiş Aa23 ve Aa23-T’nin Wolbachia enfeksiyonunun antibiyotik kullanılarak tedavi edilen Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu artıran dört yöntem kullanıldı.
Abstract
Anne tarafından barındırılan bir endosimbiyont olarak Wolbachia, böcek popülasyonlarının büyük bir bölümünü enfekte eder. Çalışmalar son zamanlarda Wolbachia-transfekte sivrisinekler kullanarak RNA virüsü iletiminin başarılı bir şekilde düzenlendiğini bildirmiştir. Virüsleri kontrol etmek için anahtar stratejiler, sitoplazmik uyumsuzluk yoluyla konakçı üremesinin manipülasyonunu ve immün hazırlama yoluyla viral transkriptlerin inhibisyonunu ve konakçı kaynaklı kaynaklar için rekabeti içerir. Bununla birlikte, Wolbachia-transfekte sivrisineklerin viral enfeksiyona verdiği yanıtların altında yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu yazıda, Wolbachia ve böcek vektörleri arasındaki etkileşimlerin anlaşılmasını arttırmak için Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 hücrelerinde nükleik asit ve protein düzeylerinde Wolbachia enfeksiyonunun in vitro tanımlanması için bir protokol sunulmaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kantitatif PCR, batı lekesi ve immünolojik analitik yöntemlerin kombine kullanımı sayesinde, Wolbachia ile enfekte olmuş hücrelerin tespiti için tek bir yöntemin kullanılmasından daha doğru olan standart bir morfolojik protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, diğer böcek taksonlarında Wolbachia enfeksiyonunun tespitine de uygulanabilir.
Introduction
Asya kaplan sivrisineği Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), Asya’da ve dünyanın diğer bölgelerinde dang virüsünün (DENV) önemli bir vektörüdür1, germ hattı ve somatik doku2,3 boyunca dağılmış iki tür hücre içi bakterinin, Wolbachia’nın (wAlbA ve wAlbB) doğal bir konakçısıdır. A. albopictus embriyolarından türetilen Aa23 hücre hattı, her ikisi de enfeksiyon4’ü destekleyen ve antibiyotik (Aa23-T) kullanılarak doğal Wolbachia enfeksiyonundan tedavi edilebilen en az iki morfolojik hücre tipinden oluşur. Aa23’ün sadece wAlbB’yi koruduğu göz önüne alındığında, konakçı-endosimbiyont etkileşimlerinin incelenmesi için yararlı bir modeldir 4,5,6.
Wolbachia maternal olarak bulaşır ve böcek türlerinin tahmini% 65’inienfekte eder 8,9 ve sivrisinek türlerinin% 28’i 10. Çeşitli dokuları enfekte eder ve konakçı ile yakın bir simbiyotik ilişki oluşturur, genellikle konakçı üreme sistemini manipüle ederek sitoplazmik uyumsuzluğa (CI)11 ve popülasyon replasmanına neden olur12,13. Bu konakçı tepkileri, Drosophila simulans14’ün doğal popülasyonlarında ve A. aegypti’de bir laboratuvar kafesi ve saha denemesi15’te gözlenmiştir. Wolbachia tarafından ortaya çıkarılan önemli bir üreme dışı manipülasyon, DENV, Chikungunya virüsü (CHIKV) ve Batı Nil virüsü (WNV) 16,17 dahil olmak üzere çeşitli patojenlere karşı konakçı direncine neden olur; bu, simbiyont 18,19’un gelişmiş doğuştan gelen bağışıklık sistemi, Wolbachia ve virüsler arasında temel konakçı kaynakları için rekabet 20 ve konakçı viral savunma yollarının manipülasyonu 21 .
Bu protokol, Wolbachia kaynaklı konakçı antiviral yanıtlarının bu altta yatan mekanizmalarını incelemek için geliştirilmiştir. Aa23 hücrelerinin hücre içi Wolbachia enfeksiyonunun tespitinde dört yöntem kullanır. Bu yöntemler, diğer konakçı türlerin hücre içi Wolbachia enfeksiyonu çalışmaları için güçlü bir teorik temel sağlar. İlk yöntem olan PCR – geleneksel klonlama prosedürlerini kullanmadan DNA’nın belirli bölgelerinin enzimatik amplifikasyonuna izin veren güçlü bir teknik – Wolbachia DNA’sını tespit etmek ve Wolbachia enfeksiyonunun varlığını / yokluğunu belirlemek için kullanıldı22. İkinci yöntem, PCR23’ten önceki şablon miktarıyla doğru orantılı olan her PCR döngüsü sırasında üretilen ürünlerin güvenilir tespiti ve ölçümü için kantitatif PCR (qPCR) kullanarak Wolbachia DNA kopya yoğunluğunu ölçer. Üçüncü yöntem, elektroforezin yüksek ayırma gücünü, antikorların özgüllüğünü ve kromojenik enzimatik reaksiyonların duyarlılığını birleştirerek karmaşık karışımlardaki spesifik proteinleri tespit etmek için en güçlü araçlardan biri olan western blot’u kullanarak hücre içi Wolbachia proteinlerinin varlığını tespit eder. Son yöntem, Wolbachia’nın hücresel alımını doğrulamak ve hücresel lokalizasyonunu belirlemek için Wolbachia yüzey proteinini (wsp) bir antijen-antikor reaksiyonu yoluyla tespit etmek için immünoloji, biyokimya ve mikroskopiyi birleştiren bir immünofloresan testidir (IFA).
Bu makalede, hücrelerde Wolbachia’nın varlığını doğrulamak için yukarıda listelenen dört yöntem açıklanmaktadır; bu, eksojen Wolbachia’nın başarılı bir şekilde transfekte edilip edilmediğini ve hücredeki Wolbachia’nın temizlenip temizlenmediğini tespit etmek için kullanılabilir. Wolbachia’nın hücrelerde mevcut olup olmadığını belirledikten sonra, genomik, proteomik veya metabolomik dahil olmak üzere çeşitli farklı analizler yapılabilir. Bu protokol, Wolbachia’nın Aa23 hücreleri aracılığıyla tespit edilmesini gösterir, ancak diğer hücrelerde de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre içi Wolbachia enfeksiyonunun saptanması, Wolbachia-konakçı etkileşimlerinin incelenmesi ve yeni suşlarla hücrelerin başarılı transfeksiyonunun doğrulanması için gereklidir. Bu protokolde, nükleik asit ve protein seviyelerinde hücre içi Wolbachia enfeksiyonunu başarılı bir şekilde tespit etmek için dört yöntem kullanılmıştır. Bu dört deneysel yöntem, hücrelerin Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu doğruladı ve geliştirdi.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Minnesota Üniversitesi’nden Dr. Xin-Ru Wang’a anlayışlı önerileri ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (No.81760374) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O’Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
- Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
- O’Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
- Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
- Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
- Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology – Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
- Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
- Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
- Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O’Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
- O’Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. . Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
- Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
- Zhang, G., Hussain, M., O’Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
- Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
- Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
- Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
- Zhou, W., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
- Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
- Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
- Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
- Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).
