Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus

La zanzara tigre asiatica Aedes albopictus (Skuse) (Ditteri: Culicidae), che è un vettore chiave del virus della dengue (DENV) in Asia e in altre parti del mondo¹, è un ospite naturale di due tipi di batteri intracellulari, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), che sono distribuiti in tutta la linea germinale e nel tessuto somatico ^2,3. La linea cellulare Aa23 derivata da embrioni di A. albopictus è costituita da almeno due tipi di cellule morfologiche, entrambe supportano l’infezione⁴ e possono essere curate dall’infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici (Aa23-T). Dato che Aa23 conserva solo wAlbB, è un modello utile per lo studio delle interazioni ospite-endosimbionte ^4,5,6.

Wolbachia è trasmesso per via materna e infetta circa il 65% delle specie di insetti ^8,9 e ^il 28% delle specie di zanzare¹⁰. Infetta una varietà di tessuti e forma un’intima relazione simbiotica con l’ospite, di solito inducendo incompatibilità citoplasmatica (CI)¹¹ e sostituzione della popolazione manipolando il sistema riproduttivo dell’ospite^12,13. Queste risposte dell’ospite sono state osservate in popolazioni naturali di Drosophila simulans¹⁴ e in A. aegypti in una gabbia di laboratorio e in una prova sul campo¹⁵. Un’importante manipolazione non riproduttiva suscitata da Wolbachia è la resistenza indotta dell’ospite a una varietà di agenti patogeni, tra cui DENV, virus Chikungunya (CHIKV) e virus del Nilo occidentale (WNV)^16,17, che può essere mediata da un sistema immunitario innato migliorato del simbionte^18,19, competizione tra Wolbachia e virus per le risorse essenziali dell’ospite²⁰ e manipolazione delle vie di difesa virale dell’ospite²¹ .

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare questi meccanismi alla base delle risposte antivirali dell’ospite indotte da Wolbachia. Utilizza quattro metodi di rilevamento dell’infezione intracellulare da Wolbachia delle cellule Aa23. Questi metodi forniscono una solida base teorica per gli studi sull’infezione intracellulare da Wolbachia di altre specie ospiti. Il primo metodo, la PCR, una potente tecnica che consente l’amplificazione enzimatica di specifiche regioni del DNA senza utilizzare procedure di clonazione convenzionali, è stato utilizzato per rilevare il DNA di Wolbachia e determinare la presenza / assenza di infezione da Wolbachia ²². Il secondo metodo misura la densità di copia del DNA di Wolbachia utilizzando la PCR quantitativa (qPCR) per il rilevamento e la misurazione affidabili dei prodotti generati durante ogni ciclo PCR che è direttamente proporzionale alla quantità di modello prima della PCR²³. Il terzo metodo rileva la presenza di proteine Wolbachia intracellulari , utilizzando western blot, uno degli strumenti più potenti per rilevare proteine specifiche in miscele complesse combinando l’elevato potere di separazione dell’elettroforesi, la specificità degli anticorpi e la sensibilità delle reazioni enzimatiche cromogeniche. Il metodo finale è un test di immunofluorescenza (IFA) che combina immunologia, biochimica e microscopia per rilevare la proteina di superficie wolbachia (wsp) attraverso una reazione antigene-anticorpo per confermare l’assorbimento cellulare di Wolbachia e determinarne la localizzazione cellulare.

Questo documento descrive i quattro metodi sopra elencati per verificare l’esistenza di Wolbachia nelle cellule, che possono essere utilizzati per rilevare se la Wolbachia esogena è stata trasfetta con successo e la Wolbachia nella cellula è stata eliminata. Dopo aver determinato se Wolbachia è presente nelle cellule o meno, è possibile eseguire una varietà di analisi diverse, tra cui genomica, proteomica o metabolomica. Questo protocollo dimostra il rilevamento di Wolbachia attraverso le cellule Aa23, ma può essere utilizzato anche in altre cellule.