تم استخدام أربع طرق للكشف عن Wolbachia داخل الخلايا ، والتي تكمل بعضها البعض وتحسن دقة الكشف عن عدوى Wolbachia من الزاعجة المشتقة من Aedes albopictus Aa23 و Aa23-T التي تم علاجها من عدوى Wolbachia الأصلية باستخدام المضادات الحيوية.
باعتبارها تكافلا داخليا مؤمنا للأمهات ، تصيب Wolbachia نسبا كبيرة من مجموعات الحشرات. وقد أفادت الدراسات مؤخرا عن التنظيم الناجح لانتقال فيروس الحمض النووي الريبي باستخدام البعوض المنقول من ولبخيا. وتشمل الاستراتيجيات الرئيسية للسيطرة على الفيروسات التلاعب بتكاثر المضيف عن طريق عدم التوافق السيتوبلازمي وتثبيط النسخ الفيروسية عن طريق التحضير المناعي والتنافس على الموارد المشتقة من المضيف. ومع ذلك ، فإن الآليات الأساسية لاستجابات البعوض المنقول من Wolbachia للعدوى الفيروسية غير مفهومة بشكل جيد. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتعرف في المختبر على عدوى الولبخية على مستويات الحمض النووي والبروتين في خلايا الزاعجة البيضاء (Diptera: Culicidae) Aa23 لتعزيز فهم التفاعلات بين Wolbachia وناقلات الحشرات الخاصة بها. من خلال الاستخدام المشترك لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، و PCR الكمي ، واللطخة الغربية ، والطرق التحليلية المناعية ، تم وصف بروتوكول مورفولوجي قياسي للكشف عن الخلايا المصابة ب Wolbachia وهو أكثر دقة من استخدام طريقة واحدة. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج للكشف عن عدوى Wolbachia في أنواع الحشرات الأخرى.
بعوضة النمر الآسيوي Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) ، وهي ناقل رئيسي لفيروس حمى الضنك (DENV) في آسيا وأجزاء أخرى من العالم1 ، هي مضيف طبيعي لنوعين من البكتيريا داخل الخلايا ، Wolbachia (w AlbA و wAlbB) ، والتي يتم توزيعها في جميع أنحاء الخط الجرثومي والأنسجة الجسدية 2,3. يتكون خط خلايا Aa23 المشتق من أجنة A. albopictus من نوعين على الأقل من الخلايا المورفولوجية ، وكلاهما يدعم العدوى4 ويمكن علاجه من عدوى Wolbachia الأصلية باستخدام المضادات الحيوية (Aa23-T). بالنظر إلى أن Aa23 يحتفظ فقط ب wAlbB ، فهو نموذج مفيد لدراسة التفاعلات بين المضيف والتكافلالداخلي 4,5,6.
ينتقل Wolbachia عن طريق الأم ويصيب ما يقدر بنحو 65٪ من أنواع الحشرات 8,9 و 28٪ من أنواع البعوض10. يصيب مجموعة متنوعة من الأنسجة ويشكل علاقة تكافلية حميمة مع المضيف ، وعادة ما يؤدي إلى عدم توافق السيتوبلازم (CI)11 واستبدال السكان عن طريق التلاعب بالجهاز التناسلي المضيف12,13. وقد لوحظت هذه الاستجابات المضيفة في المجموعات الطبيعية من ذبابة الفاكهة simulans14 وفي A. aegypti في قفص مختبري وتجربة ميدانية15. هناك تلاعب مهم غير إنجابي أثارته Wolbachia وهو مقاومة المضيف لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك DENV وفيروس Chikungunya (CHIKV) وفيروس غرب النيل (WNV) 16,17 ، والتي يمكن أن يتوسط فيها نظام المناعة الفطري المحسن للتكافل18,19 ، والمنافسة بين Wolbachia والفيروسات على الموارد المضيفة الأساسية20 ، والتلاعب بمسارات الدفاع الفيروسي المضيف21 .
تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة هذه الآليات الأساسية للاستجابات المضادة للفيروسات المضيفة التي يسببها Wolbachia. ويستخدم أربع طرق للكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا من خلايا Aa23. توفر هذه الطرق أساسا نظريا قويا لدراسات عدوى Wolbachia داخل الخلايا للأنواع المضيفة الأخرى. الطريقة الأولى ، PCR – وهي تقنية قوية تسمح بالتضخيم الأنزيمي لمناطق محددة من الحمض النووي دون استخدام إجراءات الاستنساخ التقليدية – تم استخدامها للكشف عن الحمض النووي Wolbachia وتحديد وجود / عدم وجود عدوى Wolbachia 22. تقيس الطريقة الثانية كثافة نسخ الحمض النووي Wolbachia باستخدام PCR الكمي (qPCR) للكشف والقياس الموثوق للمنتجات التي تم إنشاؤها خلال كل دورة PCR والتي تتناسب طرديا مع كمية القالب قبل PCR23. تكتشف الطريقة الثالثة وجود بروتينات Wolbachia داخل الخلايا ، باستخدام اللطخة الغربية – واحدة من أقوى الأدوات للكشف عن بروتينات محددة في مخاليط معقدة من خلال الجمع بين قوة الفصل العالية للرحلان الكهربائي ، وخصوصية الأجسام المضادة ، وحساسية التفاعلات الأنزيمية اللونية. الطريقة النهائية هي اختبار التألق المناعي (IFA) الذي يجمع بين علم المناعة والكيمياء الحيوية والفحص المجهري للكشف عن بروتين سطح Wolbachia (wsp) من خلال تفاعل الأجسام المضادة المستضدية لتأكيد الامتصاص الخلوي ل Wolbachia وتحديد توطينه الخلوي.
تصف هذه الورقة الطرق الأربع المذكورة أعلاه للتحقق من وجود Wolbachia في الخلايا ، والتي يمكن استخدامها للكشف عما إذا كان Wolbachia الخارجي قد تم نقله بنجاح وتم مسح Wolbachia في الخلية. بعد تحديد ما إذا كانت Wolbachia موجودة في الخلايا أم لا ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليلات المختلفة ، بما في ذلك علم الجينوم أو البروتيوميات أو الأيض. يوضح هذا البروتوكول اكتشاف Wolbachia من خلال خلايا Aa23 ولكن يمكن استخدامه أيضا في خلايا أخرى.
يعد الكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا أمرا ضروريا لدراسة التفاعلات بين Wolbachia ومضيف وتأكيد النقل الناجح للخلايا ذات السلالات الجديدة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام أربع طرق للكشف بنجاح عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا على مستويات الحمض النووي والبروتين. هذه الطرق التجريبية الأربع ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور شين رو وانغ من جامعة مينيسوتا على اقتراحاته وتوجيهاته الثاقبة. تم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81760374).
Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
inSituX platform | |||
Analysis software | In-house developed | ||
Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
Chip holder | In-house developed | ||
Control software | In-house developed | ||
Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
inSituX platform | In-house developed | ||
IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
Outer ring | In-house developed | ||
Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
Shim | In-house developed | ||
X-ray beam stop | In-house developed |