胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査
Summary
本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与する様々なステップを実証する。再生または完全に回復した角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。
Abstract
ひよこの胚性角膜創傷は完全かつ迅速に再生する顕著な能力を示すが、成人の創傷角膜は線維性瘢痕化による透明性の喪失を経験する。損傷した胚性角膜の組織完全性は、検出可能な瘢痕形成なしに本質的に回復される。そのアクセス性と操作の容易さを考えると、ひよこ胚は瘢痕のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルです。このプロトコルは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与するさまざまなステップを示しています。第一に、卵子は初期胚期に窓を開けられ、眼にアクセスする。第二に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作が行われ、角膜の3つの細胞層が形成されるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にする。第三に、外側上皮層および前間質を貫通する線状角膜創傷は、顕微手術ナイフを用いて作製される。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。このモデルを用いたこれまでの研究では、創傷胚性角膜が角化細胞分化の活性化を示し、ECMタンパク質の天然の三次元マクロ構造への協調的なリモデリングを受け、角膜感覚神経によって適切に再神経支配されることが明らかになった。将来的には、再生プロセスに対する内因性または外因性因子の潜在的な影響は、組織移植、エレクトロポレーション、レトロウイルス感染、またはビーズ移植などの発生生物学技術を使用して、治癒角膜において分析することができる。現在の戦略は、胚性ひよこを、瘢痕のない角膜創傷治癒を調整する分子的および細胞的要因を解明するための重要な実験パラダイムとして特定している。
Introduction
角膜は、視力を助長する光を透過および屈折させる透明で、最も外側の眼の組織である。成人角膜において、角膜間質への損傷または感染は、角化細胞増殖、線維症、サイトカイン誘発アポトーシスにつながる炎症の増加、修復筋線維芽細胞の生成、および細胞外マトリックス(ECM)の全体的なリモデリングを特徴とする迅速かつ堅牢な創傷治癒応答をもたらす1,2.損傷後、このような角膜組織修復は、角膜の透明性を低下させ、光の通過を閉塞し、したがって視力を歪め、最も重篤な症例では角膜失明につながる不透明な瘢痕組織をもたらす3。したがって、創傷治癒の複雑さに対処し、創傷閉鎖および組織再生に関与する細胞因子および分子因子を同定するために、信頼できる動物モデルを開発することが明らかに必要である。
今日まで、角膜創傷治癒を調べるほとんどの研究は、出生後4または成体動物モデル1、2、5、6、7を利用してきた。これらの研究は、角膜創傷治癒応答および瘢痕形成の根底にあるメカニズムの理解において著しい進歩をもたらしたが、これらの治癒モデルにおける損傷した角膜組織は完全に再生できず、したがって、損傷後の角膜形態および構造を完全に反復させる分子因子および細胞機構を同定するための有用性を制限する。対照的に、胎児のひよこ角膜にナイフで生じた胎児の傷は、瘢痕のない方法で完全に治癒する固有の能力を有する8。具体的には、胚性ヒナギ角膜は、細胞外マトリックス構造の完全な反復および神経支配パターン8、9を有する非線維性再生を示す。
本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで巻き取ることに関与する一連のステップを記載する。第一に、卵子は、胚へのアクセスを容易にするために、初期胚期にウィンドウ化される。第2に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作は、角膜の3つの細胞層が形成され、創傷が望まれるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にするために行われる。第三に、角膜上皮を通って前足間質に貫通する線状中枢角膜切開は、顕微手術ナイフを用いて行われる。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ひよこは胎児の、傷跡のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルシステムです。哺乳類とは異なり、ひよこは、 ovo8または ex ovo戦略24を用いて、開発全体を通して容易にアクセス可能である。胚性のひよこ角膜はげっ歯類の角膜よりもはるかに大きく、頭蓋容積のほぼ50%が眼25に捧げられており、創傷などの物理的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、イリノイ・ウェズリアン大学からTSへの芸術的および学術的開発助成金によって支援され、NIH-R01EY022158(PL)によって部分的に資金提供されました。
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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