Studiare la rigenerazione dei tessuti senza cicatrici nelle cornee embrionali dei pulcini feriti
Summary
Il presente protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. Le cornee rigeneranti o completamente restaurate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari seguendo la procedura di ferita.
Abstract
Le ferite corneali embrionali di pulcino mostrano una notevole capacità di rigenerarsi completamente e rapidamente, mentre le cornee ferite adulte sperimentano una perdita di trasparenza a causa di cicatrici fibrotiche. L’integrità tissutale delle cornee embrionali danneggiate viene intrinsecamente ripristinata senza formazione di cicatrici rilevabili. Data la sua accessibilità e facilità di manipolazione, l’embrione di pulcino è un modello ideale per studiare la riparazione della ferita corneale senza cicatrici. Questo protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. In primo luogo, le uova vengono finestre in età embrionale precoce per accedere all’occhio. In secondo luogo, una serie di manipolazioni fisiche in ovo alle membrane extraembrionali sono condotte per garantire che l’accesso all’occhio sia mantenuto attraverso le fasi successive dello sviluppo, corrispondenti a quando si formano i tre strati cellulari della cornea. In terzo luogo, le ferite corneali lineari che penetrano nello strato epiteliale esterno e nello stroma anteriore sono realizzate utilizzando un coltello microchirurgico. Il processo di rigenerazione o le cornee completamente ripristinate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari dopo la procedura di ferita. Studi condotti finora con questo modello hanno rivelato che le cornee embrionali ferite mostrano l’attivazione della differenziazione dei cheratociti, subiscono un rimodellamento coordinato delle proteine ECM alla loro macrostruttura tridimensionale nativa e diventano adeguatamente innervate dai nervi sensoriali corneali. In futuro, il potenziale impatto di fattori endogeni o esogeni sul processo rigenerativo potrebbe essere analizzato nella guarigione delle cornee utilizzando tecniche di biologia dello sviluppo, come l’innesto di tessuto, l’elettroporazione, l’infezione retrovirale o l’impianto di perline. L’attuale strategia identifica il pulcino embrionale come un paradigma sperimentale cruciale per chiarire i fattori molecolari e cellulari che coordinano la guarigione delle ferite corneali senza cicatrici.
Introduction
La cornea è il tessuto trasparente più esterno dell’occhio che trasmette e rifrange la luce favorevole all’acuità visiva. Nella cornea adulta, il danno o l’infezione allo stroma corneale porta a una risposta di guarigione delle ferite rapida e robusta caratterizzata da proliferazione dei cheratociti, fibrosi, aumento dell’infiammazione che porta ad apoptosi indotta da citochine, generazione di miofibroblasti di riparazione e rimodellamento generale della matrice extracellulare (ECM)1,2 . A seguito di lesioni, tale riparazione del tessuto corneale si traduce in tessuto cicatriziale opaco che riduce la trasparenza corneale e occlude il passaggio della luce, distorcendo così la visione e, nei casi più gravi, portando alla cecità corneale3. Pertanto, vi è una chiara necessità di sviluppare modelli animali affidabili per affrontare le complessità della guarigione delle ferite e identificare i fattori cellulari e molecolari responsabili della chiusura delle ferite e della rigenerazione dei tessuti.
Ad oggi, la maggior parte degli studi che esaminano la guarigione delle ferite corneali hanno utilizzato modelli animali post-natali4 o adulti 1,2,5,6,7. Mentre questi studi hanno portato a un significativo progresso nella comprensione della risposta di guarigione delle ferite corneali e dei meccanismi alla base della formazione di cicatrici, i tessuti corneali danneggiati in questi modelli di guarigione non riescono a rigenerarsi completamente, limitando così la loro utilità per identificare i fattori molecolari e i meccanismi cellulari responsabili della completa ricapitolazione della morfologia corneale e della struttura post-lesione. Al contrario, le ferite fetali generate con un coltello nella cornea embrionale del pulcino possiedono una capacità intrinseca di guarire completamente in modo senza cicatrici8. In particolare, la cornea embrionale del pulcino mostra una rigenerazione non fibrosa con la completa ricapitolazione della struttura della matrice extracellulare e dei modelli di innervazione 8,9.
Il presente protocollo descrive una sequenza di passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. In primo luogo, le uova vengono finestrate in età embrionale precoce per facilitare l’accesso all’embrione. In secondo luogo, una serie di manipolazioni fisiche in ovo alle membrane extraembrionali sono condotte per garantire che l’accesso all’occhio sia mantenuto attraverso le fasi successive dello sviluppo, corrispondenti a quando si formano i tre strati cellulari della cornea e si desidera la ferita. In terzo luogo, le incisioni lineari della cornea centrale che penetrano attraverso l’epitelio corneale e nello stroma anteriore sono fatte usando un coltello microchirurgico. Il processo di rigenerazione o le cornee completamente ripristinate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari dopo la procedura di ferita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il pulcino è un sistema modello ideale per studiare la riparazione della ferita corneale fetale e senza cicatrici. A differenza dei mammiferi, il pulcino è facilmente accessibile durante tutto lo sviluppo utilizzando le strategie ovo8 o ex ovo 24. La cornea embrionale del pulcino è molto più grande delle cornee dei roditori, con quasi il 50% del volume cranico dedicato all’occhio25, rendendolo altamente suscettibile di manipolaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per lo sviluppo artistico e accademico attraverso l’Illinois Wesleyan University a TS e finanziato in parte da NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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