Исследование регенерации безрубцовой ткани в эмбриональных раненых роговицах цыплят
Summary
Настоящий протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Регенерирующая или полностью восстановленная роговица может быть проанализирована на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранения.
Abstract
Эмбриональные раны роговицы цыплят демонстрируют замечательную способность к полной и быстрой регенерации, тогда как взрослые раненые роговицы испытывают потерю прозрачности из-за фиброзного рубцевания. Тканевая целостность поврежденных эмбриональных роговиц восстанавливается без обнаружения образования рубцов. Учитывая его доступность и простоту манипуляций, эмбрион цыпленка является идеальной моделью для изучения заживления ран роговицы без шрамов. Этот протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте для доступа к глазу. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда формируются три клеточных слоя роговицы. В-третьих, линейные раны роговицы, которые проникают во внешний эпителиальный слой и переднюю строму, изготавливаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования. Исследования, проведенные на сегодняшний день с использованием этой модели, показали, что раненые эмбриональные роговицы демонстрируют активацию дифференцировки кератоцитов, подвергаются скоординированному ремоделированию белков ECM в их родную трехмерную макроструктуру и адекватно реиннервируются сенсорными нервами роговицы. В будущем потенциальное влияние эндогенных или экзогенных факторов на регенеративный процесс может быть проанализировано при заживлении роговицы с использованием методов биологии развития, таких как пересадка тканей, электропорация, ретровирусная инфекция или имплантация бусин. Текущая стратегия определяет эмбрионального цыпленка как важнейшую экспериментальную парадигму для выяснения молекулярных и клеточных факторов, координирующих заживление ран роговицы без шрамов.
Introduction
Роговица – это прозрачная, самая внешняя ткань глаза, которая пропускает и преломляет свет, способствующий остроте зрения. Во взрослой роговице повреждение или инфекция стромы роговицы приводит к быстрой и надежной реакции заживления ран, характеризующейся пролиферацией кератоцитов, фиброзом, усилением воспаления, приводящего к цитокин-индуцированному апоптозу, генерацией репарации миофибробластов и общим ремоделированием внеклеточного матрикса (ECM)1,2 . После травмы такое восстановление ткани роговицы приводит к непрозрачной рубцовой ткани, которая снижает прозрачность роговицы и закупоривает прохождение света, тем самым искажая зрение и, в наиболее тяжелых случаях, приводя к слепоте роговицы3. Таким образом, существует явная необходимость в разработке надежных животных моделей для решения сложных проблем заживления ран и выявления клеточных и молекулярных факторов, ответственных за закрытие раны и регенерацию тканей.
На сегодняшний день в большинстве исследований, изучающих заживление ран роговицы, использовались послеродовыемодели 4 или взрослых животных 1,2,5,6,7. Хотя эти исследования привели к значительному прогрессу в понимании реакции заживления раны роговицы и механизмов, лежащих в основе образования рубцов, поврежденные ткани роговицы в этих моделях заживления не могут полностью регенерировать, что ограничивает их полезность для идентификации молекулярных факторов и клеточных механизмов, ответственных за полное повторение морфологии и структуры роговицы после травмы. Напротив, раны плода, полученные ножом в эмбриональной роговице цыпленка, обладают внутренней способностью полностью заживать без шрамов8. В частности, эмбриональная роговица цыпленка демонстрирует нефибротическую регенерацию с полной рекапитуляцией структуры внеклеточного матрикса и паттернами иннервации 8,9.
Настоящий протокол описывает последовательность этапов, участвующих в ранении роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте, чтобы облегчить доступ к эмбриону. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда образуются три клеточных слоя роговицы и желательна ранение. В-третьих, линейные центральные разрезы роговицы, проникающие через эпителий роговицы и в переднюю строму, делаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цыпленок является идеальной модельной системой для изучения заживления ран роговицы плода без шрамов. В отличие от млекопитающих, птенец легко доступен на протяжении всего развития, используя стратегии ovo8 или ex ovo 24. Эмбриональная роговица цыпленка ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом на художественное и научное развитие через Иллинойский Уэслианский университет TS и частично финансировалась NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
