Untersuchung der narbenlosen Geweberegeneration bei embryonalen verwundeten Kükenhornhäuten
Summary
Das vorliegende Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte auf, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Die regenerierenden oder vollständig wiederhergestellten Hornhäute können nach dem Wundvorgang mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken auf Regenerationspotenzial analysiert werden.
Abstract
Embryonale Hornhautwunden von Küken zeigen eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich vollständig und schnell zu regenerieren, während erwachsene verwundete Hornhäute aufgrund fibrotischer Narbenbildung einen Verlust an Transparenz erfahren. Die Gewebeintegrität verletzter embryonaler Hornhäute wird intrinsisch wiederhergestellt, ohne dass Narbenbildung erkennbar ist. Aufgrund seiner Zugänglichkeit und einfachen Manipulation ist der Kükenembryo ein ideales Modell für die Untersuchung der narbenlosen Hornhautwundreparatur. Dieses Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Zuerst werden Eier im frühen Embryonalalter gefenstert, um Zugang zum Auge zu erhalten. Zweitens wird eine Reihe von physikalischen In-Ovo-Manipulationen an den extraembryonalen Membranen durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Zugang zum Auge in späteren Entwicklungsstadien aufrechterhalten wird, entsprechend dem Zeitpunkt, zu dem die drei Zellschichten der Hornhaut gebildet werden. Drittens werden lineare Hornhautwunden, die die äußere Epithelschicht und das vordere Stroma durchdringen, mit einem mikrochirurgischen Messer hergestellt. Der Regenerationsprozess oder vollständig wiederhergestellte Hornhäute können mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken nach dem Verwundungsverfahren auf Regenerationspotenzial analysiert werden. Bisherige Studien, die dieses Modell verwenden, haben gezeigt, dass verwundete embryonale Hornhäute eine Aktivierung der Keratozytendifferenzierung aufweisen, eine koordinierte Umgestaltung von ECM-Proteinen in ihre native dreidimensionale Makrostruktur durchlaufen und von sensorischen Hornhautnerven angemessen reinnerviert werden. In Zukunft könnte der mögliche Einfluss endogener oder exogener Faktoren auf den regenerativen Prozess bei heilenden Hornhäuten mit entwicklungsbiologischen Techniken wie Gewebetransplantation, Elektroporation, retroviraler Infektion oder Perlenimplantation analysiert werden. Die aktuelle Strategie identifiziert das embryonale Küken als ein entscheidendes experimentelles Paradigma zur Aufklärung der molekularen und zellulären Faktoren, die die heilung der narbenlosen Hornhautwunden koordinieren.
Introduction
Die Hornhaut ist das transparente, äußerste Gewebe des Auges, das Licht überträgt und bricht, was der Sehschärfe förderlich ist. In der adulten Hornhaut führt eine Schädigung oder Infektion des Hornhautstromas zu einer schnellen und robusten Wundheilungsreaktion, die durch Keratozytenproliferation, Fibrose, erhöhte Entzündung, die zu Zytokin-induzierter Apoptose führt, Erzeugung von Reparatur-Myofibroblasten und Gesamtumbau der extrazellulären Matrix (ECM) gekennzeichnet ist1,2 . Nach einer Verletzung führt eine solche Hornhautgewebereparatur zu undurchsichtigem Narbengewebe, das die Transparenz der Hornhaut verringert und den Lichtdurchgang verdeckt, wodurch das Sehvermögen verzerrt wird und in den schwersten Fällen zur Hornhautblindheitführt 3. Daher besteht ein klarer Bedarf, zuverlässige Tiermodelle zu entwickeln, um die Komplexität der Wundheilung anzugehen und die zellulären und molekularen Faktoren zu identifizieren, die für den Wundverschluss und die Geweberegeneration verantwortlich sind.
Bis heute haben die meisten Studien, die die Heilung von Hornhautwunden untersuchen, postnatale4- oder erwachsene Tiermodelle 1,2,5,6,7 verwendet. Während diese Studien zu einem signifikanten Fortschritt im Verständnis der Hornhautwundheilungsreaktion und der Mechanismen, die der Narbenbildung zugrunde liegen, geführt haben, können sich die beschädigten Hornhautgewebe in diesen Heilungsmodellen nicht vollständig regenerieren, wodurch ihr Nutzen für die Identifizierung der molekularen Faktoren und zellulären Mechanismen, die für die vollständige Rekapitulation der Hornhautmorphologie und -struktur nach der Verletzung verantwortlich sind, eingeschränkt wird. Im Gegensatz dazu besitzen fetale Wunden, die mit einem Messer in der embryonalen Kükenhornhaut erzeugt werden, eine intrinsische Fähigkeit, auf narbenlose Weise vollständig zu heilen8. Insbesondere zeigt die embryonale Kükenhornhaut eine nichtfibrotische Regeneration mit der vollständigen Rekapitulation der extrazellulären Matrixstruktur und der Innervationsmuster 8,9.
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Abfolge von Schritten, die an der Verwundung der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo beteiligt sind. Erstens werden die Eier im frühen Embryonalalter gefenstert, um den Zugang zum Embryo zu erleichtern. Zweitens wird eine Reihe von physikalischen In-Ovo-Manipulationen an den extraembryonalen Membranen durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Zugang zum Auge in späteren Entwicklungsstadien aufrechterhalten wird, je nachdem, wann die drei Zellschichten der Hornhaut gebildet werden und eine Verwundung gewünscht ist. Drittens werden lineare zentrale Hornhautschnitte, die durch das Hornhautepithel und in das vordere Stroma eindringen, mit einem mikrochirurgischen Messer durchgeführt. Der Regenerationsprozess oder vollständig wiederhergestellte Hornhäute können mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken nach dem Verwundungsverfahren auf Regenerationspotenzial analysiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Küken ist ein ideales Modellsystem für die Untersuchung der fetalen, narbenlosen Hornhautwundenreparatur. Im Gegensatz zu Säugetieren ist das Küken während der gesamten Entwicklung mit den Strategien in ovo 8 oder ex ovo 24 leicht zugänglich. Die embryonale Kükenhornhaut ist viel größer als die Hornhaut von Nagetieren, wobei fast 50% des Schädelvolumens dem Augegewidmet sind 25, was sie sehr anfällig für körperliche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für künstlerische und wissenschaftliche Entwicklung durch die Illinois Wesleyan University an TS unterstützt und teilweise von NIH-R01EY022158 (PL) finanziert.
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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