التحقيق في تجديد الأنسجة الخالية من الندوب في قرنية الفرخ الجنينية المصابة
Summary
يوضح هذا البروتوكول الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها جرح قرنية كتكوت جنيني في البيض. يمكن تحليل القرنيات المجددة أو المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح.
Abstract
تظهر جروح القرنية الجنينية في الفرخ قدرة ملحوظة على التجدد الكامل والسريع ، في حين تعاني القرنيات المصابة البالغة من فقدان الشفافية بسبب الندوب الليفية. يتم استعادة سلامة أنسجة القرنيات الجنينية المصابة بشكل جوهري مع عدم وجود ندبة يمكن اكتشافها. نظرا لسهولة الوصول إليه وسهولة التلاعب به ، يعد جنين الفرخ نموذجا مثاليا لدراسة إصلاح جرح القرنية بدون ندبة. يوضح هذا البروتوكول الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها جرح قرنية الفرخ الجنيني في البيض. أولا ، يتم وضع البيض في العصور الجنينية المبكرة للوصول إلى العين. ثانيا ، يتم إجراء سلسلة من التلاعب الفيزيائي في البويضة للأغشية خارج الجنين لضمان الحفاظ على الوصول إلى العين خلال مراحل لاحقة من التطور ، تتوافق مع وقت تشكيل الطبقات الخلوية الثلاث للقرنية. ثالثا ، يتم إجراء جروح القرنية الخطية التي تخترق الطبقة الظهارية الخارجية والسدى الأمامي باستخدام سكين جراحي مجهري. يمكن تحليل عملية التجديد أو القرنيات المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح. وقد كشفت الدراسات التي أجريت حتى الآن باستخدام هذا النموذج أن القرنيات الجنينية المصابة تظهر تنشيط تمايز الخلايا القرنية، وتخضع لإعادة تشكيل منسقة لبروتينات ECM إلى بنيتها الكلية ثلاثية الأبعاد الأصلية، وتصبح معصبة بشكل كاف بواسطة الأعصاب الحسية القرنية. في المستقبل ، يمكن تحليل التأثير المحتمل للعوامل الداخلية أو الخارجية على عملية التجدد في القرنيات الشافية باستخدام تقنيات البيولوجيا التنموية ، مثل تطعيم الأنسجة ، أو الكهربية ، أو العدوى الفيروسية الرجعية ، أو زرع الخرز. تحدد الاستراتيجية الحالية الفرخ الجنيني كنموذج تجريبي حاسم لتوضيح العوامل الجزيئية والخلوية التي تنسق التئام جروح القرنية بدون ندوب.
Introduction
القرنية هي النسيج الشفاف والخارجي للعين الذي ينقل وينكسر الضوء الذي يؤدي إلى حدة البصر. في القرنية البالغة ، يؤدي تلف أو عدوى سدى القرنية إلى استجابة سريعة وقوية لالتئام الجروح تتميز بانتشار الخلايا القرنية ، والتليف ، وزيادة الالتهاب الذي يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين ، وتوليد الخلايا الليفية العضلية الإصلاحية ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) بشكل عام 1,2 . بعد الإصابة ، يؤدي إصلاح أنسجة القرنية هذا إلى أنسجة ندبية غير شفافة تقلل من شفافية القرنية وتمنع مرور الضوء ، وبالتالي تشوه الرؤية ، وفي الحالات الشديدة ، تؤدي إلى عمى القرنية3. وبالتالي ، هناك حاجة واضحة لتطوير نماذج حيوانية موثوقة لمعالجة تعقيدات التئام الجروح وتحديد العوامل الخلوية والجزيئية المسؤولة عن إغلاق الجروح وتجديد الأنسجة.
حتى الآن ، استخدمت معظم الدراسات التي تدرس التئام جروح القرنية نماذج حيوانية بعد الولادة4 أو البالغين1،2،5،6،7. في حين أن هذه الدراسات قد أدت إلى تقدم كبير في فهم استجابة التئام جروح القرنية والآليات الكامنة وراء تكوين الندبات ، فإن أنسجة القرنية التالفة في نماذج الشفاء هذه تفشل في التجدد الكامل ، مما يحد من فائدتها لتحديد العوامل الجزيئية والآليات الخلوية المسؤولة عن تلخيص كامل لمورفولوجيا القرنية وهيكلها بعد الإصابة. على النقيض من ذلك ، فإن جروح الجنين الناتجة بسكين في قرنية الفرخ الجنينية تمتلك قدرة جوهرية على الشفاء التام بطريقة خالية من الندوب8. على وجه التحديد ، تظهر قرنية الفرخ الجنينية تجديدا غير ليفي مع التلخيص الكامل لبنية المصفوفة خارج الخلية وأنماط التعصيب 8,9.
يصف هذا البروتوكول سلسلة من الخطوات التي ينطوي عليها جرح قرنية كتكوت جنيني في البيض. أولا ، يتم وضع البيض في الأعمار الجنينية المبكرة لتسهيل الوصول إلى الجنين. ثانيا ، يتم إجراء سلسلة من التلاعب الفيزيائي في البويضة للأغشية خارج الجنين لضمان الحفاظ على الوصول إلى العين خلال مراحل لاحقة من التطور ، تتوافق مع وقت تشكل الطبقات الخلوية الثلاث للقرنية ويكون الجرح مطلوبا. ثالثا ، يتم إجراء شقوق القرنية المركزية الخطية التي تخترق ظهارة القرنية وفي السدى الأمامي باستخدام سكين جراحي مجهري. يمكن تحليل عملية التجديد أو القرنيات المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفرخ هو نظام نموذجي مثالي لدراسة إصلاح جرح القرنية الجنيني الخالي من الندوب. على عكس الثدييات ، يمكن الوصول بسهولة إلى الفرخ طوال فترة التطوير باستخدام استراتيجيات ovo 8 أو ex ovo 24. قرنية الفرخ الجنينية أكبر بكثير من قرنية القوارض ، مع ما يقرب من 50 ٪ من حجم ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة التطوير الفني والعلمي من خلال جامعة إلينوي ويسليان إلى TS وبتمويل جزئي من NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
