חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.
Abstract
פצעי הקרנית העובריים של אפרוחים מציגים יכולת יוצאת דופן להתחדש באופן מלא ומהיר, בעוד שקרניות פצועות בוגרות חוות אובדן שקיפות עקב הצטלקות פיברוטית. שלמות הרקמה של הקרנית העוברית הפצועה משוחזרת באופן מהותי ללא היווצרות צלקת הניתנת לזיהוי. בהתחשב בנגישותו ובקלות המניפולציה שלו, עובר האפרוח הוא מודל אידיאלי לחקר תיקון פצעי הקרנית ללא צלקות. פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים העובריים המוקדמים כדי לגשת לעין. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-אמבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבי התפתחות מאוחרים יותר, המתאימים למועד שבו נוצרות שלוש השכבות התאית של הקרנית. שלישית, פצעי קרנית ליניאריים החודרים לשכבת האפיתל החיצונית ולסטרומה הקדמית מיוצרים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה. מחקרים שנערכו עד כה באמצעות מודל זה גילו כי קרניות עובריות פצועות מציגות הפעלה של התמיינות קרטוציטים, עוברות שיפוץ מתואם של חלבוני ECM למבנה המאקרו התלת-ממדי הטבעי שלהן, והופכות להיות מופנמות מחדש כראוי על ידי עצבים חושיים של הקרנית. בעתיד, ניתן יהיה לנתח את ההשפעה הפוטנציאלית של גורמים אנדוגניים או אקסוגניים על תהליך ההתחדשות בריפוי קרניות באמצעות טכניקות ביולוגיות התפתחותיות, כגון השתלת רקמות, אלקטרופורציה, זיהום רטרו-ויראלי או השתלת חרוזים. האסטרטגיה הנוכחית מזהה את הגוזל העוברי כפרדיגמה ניסיונית מכרעת להבהרת הגורמים המולקולריים והתאיים המתאמים את ריפוי פצעי הקרנית ללא צלקות.
Introduction
הקרנית היא הרקמה השקופה והחיצונית ביותר של העין שמעבירה ושוברת אור התורם לחדות הראייה. בקרנית הבוגרת, נזק או זיהום לסטרומה הקרנית מובילים לתגובת ריפוי פצעים מהירה וחזקה המאופיינת בשגשוג קרטוסיטים, פיברוזיס, דלקת מוגברת המובילה לאפופטוזיס הנגרמת על ידי ציטוקינים, יצירת מיופיברובלסטים לתיקון, ושיפוץ כולל של המטריצה החוץ-תאית (ECM)1,2 . בעקבות הפציעה, תיקון רקמת הקרנית גורם לרקמת צלקת אטומה המפחיתה את שקיפות הקרנית ומונעת את מעבר האור, ובכך מעוותת את הראייה ובמקרים הקשים ביותר, מובילה לעיוורון הקרנית3. לפיכך, יש צורך ברור לפתח מודלים אמינים של בעלי חיים כדי לטפל במורכבות של ריפוי פצעים ולזהות את הגורמים התאיים והמולקולריים האחראים לסגירת פצעים ולהתחדשות רקמות.
עד כה, רוב המחקרים שבחנו ריפוי פצעי קרנית השתמשו במודלים של בעלי חיים לאחר הלידה4 או בוגרים 1,2,5,6,7. בעוד שמחקרים אלה הובילו להתקדמות משמעותית בהבנת תגובת ריפוי פצעי הקרנית והמנגנונים העומדים בבסיס היווצרות צלקות, רקמות הקרנית הפגועות במודלי ריפוי אלה אינן מצליחות להתחדש באופן מלא, ובכך מגבילות את התועלת שלהן לזיהוי הגורמים המולקולריים והמנגנונים התאיים האחראים לשיקום מלא של המורפולוגיה והמבנה הקרנית לאחר הפציעה. לעומת זאת, פצעים עובריים הנוצרים באמצעות סכין בקרנית האפרוח העוברי הם בעלי יכולת פנימית להחלים באופן מלא בצורה נטולת צלקות8. באופן ספציפי, קרנית האפרוח העוברית מציגה התחדשות לא-פיברוטית עם שחזור מלא של מבנה המטריצה החוץ-תאית ודפוסי העצבנות 8,9.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר רצף של שלבים המעורבים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים עובריים מוקדמים כדי להקל על הגישה לעובר. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-ממבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, המתאימים לזמן שבו נוצרות שלוש השכבות התאיות של הקרנית ורצוי פצע. שלישית, חתכי קרנית מרכזיים ליניאריים החודרים דרך אפיתל הקרנית ולתוך הסטרומה הקדמית נעשים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האפרוח הוא מערכת מודל אידיאלית לחקר תיקון פצעי קרנית עובריים, ללא צלקות. בניגוד ליונקים, האפרוח נגיש בקלות לאורך כל הפיתוח באמצעות אסטרטגיות אובו8 או אקס אובו 24. הקרנית של האפרוח העוברי גדולה בהרבה מהקרניות של מכרסמים, כאשר כמעט 50% מנפח הגולגולת מוקדש לע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח אמנותי ומלומד דרך אוניברסיטת אילינוי ווסליאן ל- TS ומומנה בחלקה על ידי NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
