Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

La microglía se origina a partir de progenitores de saco vitelino, que llegan al cerebro embrionario muy temprano y participan en el desarrollo del SNC ^1,2. Por ejemplo, están involucrados en la poda sináptica³ y regulan el crecimiento axonal⁴. Secretan factores que promueven la supervivencia neuronal y ayudan a la localización neuronal⁵. Al mismo tiempo, están involucrados en la eliminación de células anormales y células apoptóticas para garantizar el desarrollo normal del cerebro⁶. Además, como las células inmunocompetentes del cerebro, la microglía vigila continuamente el parénquima cerebral para eliminar las células muertas, las sinapsis disfuncionales y los desechos celulares⁷. Se ha demostrado que la activación microglial juega un papel importante en una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades inflamatorias desmielinizantes, las enfermedades neurodegenerativas y los tumores cerebrales. La microglía activada en la esclerosis múltiple (EM) contribuye a la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) y a la regeneración de la mielina al envolver los restos de mielina⁸.

En la enfermedad de Alzheimer (EA), la acumulación de beta amiloide (Aβ) activa la microglía, que afecta las funciones fagocíticas e inflamatorias de la microglía⁹. La microglía activada en el tejido del glioma, llamada microglía asociada al glioma (GAM), puede regular la progresión del glioma y, en última instancia, afectar el pronóstico de los pacientes¹⁰. La activación altera profundamente el transcriptoma microglial, lo que resulta en cambios morfológicos, expresión de receptores inmunes, aumento de la actividad fagocítica y aumento de la secreción de citoquinas¹¹. Existen diferentes subconjuntos de microglía activada en enfermedades neurodegenerativas como la microglía asociada a la enfermedad (DAM), la microglía de respuesta activada (ARM) y el fenotipo neurodegenerativo microglial (MGnD)⁸.

Del mismo modo, múltiples subconjuntos funcionales dinámicos de microglia también coexisten en el cerebro en enfermedades desmielinizantes inflamatorias¹². Comprender la heterogeneidad entre los diferentes subconjuntos de microglía es esencial para investigar la patogénesis de las enfermedades inflamatorias desmielinizantes y encontrar sus posibles estrategias terapéuticas. La heterogeneidad de la microglía depende principalmente de la especificidad molecular⁸. Es esencial describir con precisión las alteraciones moleculares de la microglía para el estudio de la heterogeneidad. Los avances en la tecnología de secuenciación de ARN unicelular (RNA-seq) han permitido identificar las características moleculares de la microglía activada en condiciones patológicas¹³. Por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones celulares es fundamental para una mayor investigación de estas células diana en condiciones específicas.

Los estudios realizados para comprender las características y funciones de la microglía suelen ser estudios in vitro, ya que se ha encontrado que se puede preparar y cultivar un gran número de microglía primaria a partir de cerebros de cachorros de ratón (1-3 días de edad), que se adhieren a los matraces de cultivo y crecen en la superficie plástica con otras células gliales mixtas. Posteriormente, la microglía pura se puede aislar en función de la diferente adhesividad de las células gliales mixtas^14,15. Sin embargo, este método solo puede aislar la microglía del cerebro perinatal y toma varias semanas. Las variables potenciales en el cultivo celular pueden influir en las características microgliales como la expresión molecular¹⁶. Además, la microglía aislada por estos métodos solo puede participar en experimentos in vitro simulando las condiciones de las enfermedades del SNC y no puede representar las características y funciones de la microglía en estados de enfermedad in vivo. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos para aislar la microglía del cerebro del ratón adulto.

La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la separación magnética son dos métodos ampliamente utilizados, aunque tienen sus propias limitaciones diferentes 16,17,18,19. Sus respectivas ventajas y desventajas se contrastarán en la sección de discusión. La maduración de la tecnología MACS ofrece la posibilidad de purificar rápidamente las células. Huang et al. han desarrollado un método conveniente para etiquetar lesiones desmielinizantes en cerebros²⁰. Combinando estos dos enfoques técnicos, proponemos un protocolo de separación magnética columnar CD11b rápido y eficiente, proporcionando una descripción paso a paso para aislar la microglía alrededor de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones adultos y preservar las características moleculares de la microglía. Las lesiones desmielinizantes focales fueron causadas por la inyección estereotáctica de 2 μL de solución de lisolecitina (1% LPC en NaCl al 0,9%) en el cuerpo calloso 3 días antes de iniciar el protocolo²¹. Este protocolo sienta las bases para realizar el siguiente paso en experimentos in vitro. Además, este protocolo ahorra tiempo y sigue siendo factible para su uso generalizado en varios experimentos.