Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Le microglia provengono da progenitori del sacco vitellino, che raggiungono il cervello embrionale molto presto e partecipano allo sviluppo del SNC ^1,2. Ad esempio, sono coinvolti nella potatura sinaptica³ e nella regolazione della crescita assonale⁴. Secernono fattori che promuovono la sopravvivenza neuronale e aiutano la localizzazione neuronale⁵. Allo stesso tempo, sono coinvolti nella rimozione di cellule anormali e cellule apoptotiche per garantire il normale sviluppo del cervello⁶. Inoltre, come cellule immuno-competenti del cervello, le microglia sorvegliano continuamente il parenchima cerebrale per eliminare le cellule morte, le sinapsi disfunzionali e i detriti cellulari⁷. È stato dimostrato che l’attivazione microgliale svolge un ruolo importante in una varietà di malattie, tra cui malattie infiammatorie demielinizzanti, malattie neurodegenerative e tumori cerebrali. Le microglia attivate nella sclerosi multipla (SM) contribuiscono alla differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) e alla rigenerazione della mielina inghiottendo i detriti^{mielinici 8}.

Nella malattia di Alzheimer (AD), l’accumulo di amiloide-beta (Aβ) attiva la microglia, che colpisce le funzioni fagocitiche e infiammatorie della microglia⁹. La microglia attivata nel tessuto del glioma, chiamata microglia associata al glioma (GAM), può regolare la progressione del glioma e, infine, influenzare la prognosi dei pazienti¹⁰. L’attivazione altera profondamente il trascrittoma microgliale, con conseguenti cambiamenti morfologici, espressione dei recettori immunitari, aumento dell’attività fagocitica e aumento della secrezione di citochine¹¹. Esistono diversi sottoinsiemi di microglia attivate nelle malattie neurodegenerative come la microglia associata alla malattia (DAM), la microglia a risposta attivata (ARM) e il fenotipo neurodegenerativo microgliale (MGnD)⁸.

Allo stesso modo, più sottoinsiemi funzionali dinamici di microglia coesistono anche nel cervello nelle malattie infiammatorie demielinizzanti¹². Comprendere l’eterogeneità tra diversi sottoinsiemi di microglia è essenziale per studiare la patogenesi delle malattie demielinizzanti infiammatorie e per trovare le loro potenziali strategie terapeutiche. L’eterogeneità della microglia dipende principalmente dalla specificità molecolare⁸. È essenziale descrivere accuratamente le alterazioni molecolari della microglia per lo studio dell’eterogeneità. I progressi nella tecnologia di sequenziamento dell’RNA a singola cellula (RNA-seq) hanno permesso l’identificazione delle caratteristiche molecolari della microglia attivata in condizioni patologiche¹³. Pertanto, la capacità di isolare le popolazioni cellulari è fondamentale per ulteriori indagini su queste cellule bersaglio in condizioni specifiche.

Gli studi condotti per comprendere le caratteristiche e le funzioni della microglia sono di solito studi in vitro, poiché è stato riscontrato che un gran numero di microglia primarie possono essere preparate e coltivate dal cervello del cucciolo di topo (1-3 giorni), che si attaccano ai palloni di coltura e crescono sulla superficie plastica con altre cellule gliali miste. Successivamente, la microglia pura può essere isolata in base alla diversa adesività delle cellule gliali miste^14,15. Tuttavia, questo metodo può solo isolare la microglia dal cervello perinatale e richiede diverse settimane. Le potenziali variabili in coltura cellulare possono influenzare le caratteristiche microgliali come l’espressione molecolare¹⁶. Inoltre, le microglia isolate con questi metodi possono partecipare solo a esperimenti in vitro simulando le condizioni delle malattie del SNC e non possono rappresentare le caratteristiche e le funzioni della microglia negli stati di malattia in vivo. Pertanto, è necessario sviluppare metodi per isolare la microglia dal cervello del topo adulto.

Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la separazione magnetica sono due metodi ampiamente utilizzati, sebbene abbiano i loro diversi limiti 16,17,18,19. I loro rispettivi vantaggi e svantaggi saranno contrastati nella sezione di discussione. La maturazione della tecnologia MACS offre la possibilità di purificare rapidamente le cellule. Huang et al. hanno sviluppato un metodo conveniente per etichettare le lesioni demielinizzanti nel cervello²⁰. Combinando questi due approcci tecnici, proponiamo un protocollo di separazione magnetica CD11b colonnare rapido ed efficiente, fornendo una descrizione passo-passo per isolare la microglia attorno a lesioni demielinizzanti nel cervello di topo adulto e preservare le caratteristiche molecolari della microglia. Le lesioni demielinizzanti focali sono state causate dall’iniezione stereotassica di 2 μL di soluzione di lisolecitina (1% LPC in 0,9% NaCl) nel corpo calloso 3 giorni prima di iniziare il protocollo²¹. Questo protocollo pone le basi per eseguire il passo successivo in esperimenti in vitro. Inoltre, questo protocollo consente di risparmiare tempo e rimane fattibile per un uso diffuso in vari esperimenti.