Summary

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Published: April 05, 2022
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.

Abstract

Le microglia, le cellule immunitarie innate residenti nel cervello, sono i principali rispondenti all’infiammazione o alle lesioni nel sistema nervoso centrale (SNC). La microglia può essere suddivisa in stato di riposo e stato attivato e può cambiare rapidamente stato in risposta al microambiente del cervello. Le microglia saranno attivate in diverse condizioni patologiche e presenteranno fenotipi diversi. Inoltre, ci sono molti sottogruppi diversi di microglia attivate e una grande eterogeneità tra diversi sottogruppi. L’eterogeneità dipende principalmente dalla specificità molecolare della microglia. Gli studi hanno rivelato che la microglia sarà attivata e svolgerà un ruolo importante nel processo patologico di demielinizzazione infiammatoria. Per comprendere meglio le caratteristiche della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti come la sclerosi multipla e il disturbo dello spettro della neuromielite ottica, proponiamo un protocollo di smistamento microgliale primario perilesionale. Questo protocollo utilizza il cartomanziamento cellulare attivato magneticamente colonnare (MACS) per ottenere microglia primarie altamente purificate e preservare le caratteristiche molecolari della microglia per studiare i potenziali effetti della microglia nelle malattie demielinizzanti infiammatorie.

Introduction

Le microglia provengono da progenitori del sacco vitellino, che raggiungono il cervello embrionale molto presto e partecipano allo sviluppo del SNC 1,2. Ad esempio, sono coinvolti nella potatura sinaptica3 e nella regolazione della crescita assonale4. Secernono fattori che promuovono la sopravvivenza neuronale e aiutano la localizzazione neuronale5. Allo stesso tempo, sono coinvolti nella rimozione di cellule anormali e cellule apoptotiche per garantire il normale sviluppo del cervello6. Inoltre, come cellule immuno-competenti del cervello, le microglia sorvegliano continuamente il parenchima cerebrale per eliminare le cellule morte, le sinapsi disfunzionali e i detriti cellulari7. È stato dimostrato che l’attivazione microgliale svolge un ruolo importante in una varietà di malattie, tra cui malattie infiammatorie demielinizzanti, malattie neurodegenerative e tumori cerebrali. Le microglia attivate nella sclerosi multipla (SM) contribuiscono alla differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) e alla rigenerazione della mielina inghiottendo i detritimielinici 8.

Nella malattia di Alzheimer (AD), l’accumulo di amiloide-beta (Aβ) attiva la microglia, che colpisce le funzioni fagocitiche e infiammatorie della microglia9. La microglia attivata nel tessuto del glioma, chiamata microglia associata al glioma (GAM), può regolare la progressione del glioma e, infine, influenzare la prognosi dei pazienti10. L’attivazione altera profondamente il trascrittoma microgliale, con conseguenti cambiamenti morfologici, espressione dei recettori immunitari, aumento dell’attività fagocitica e aumento della secrezione di citochine11. Esistono diversi sottoinsiemi di microglia attivate nelle malattie neurodegenerative come la microglia associata alla malattia (DAM), la microglia a risposta attivata (ARM) e il fenotipo neurodegenerativo microgliale (MGnD)8.

Allo stesso modo, più sottoinsiemi funzionali dinamici di microglia coesistono anche nel cervello nelle malattie infiammatorie demielinizzanti12. Comprendere l’eterogeneità tra diversi sottoinsiemi di microglia è essenziale per studiare la patogenesi delle malattie demielinizzanti infiammatorie e per trovare le loro potenziali strategie terapeutiche. L’eterogeneità della microglia dipende principalmente dalla specificità molecolare8. È essenziale descrivere accuratamente le alterazioni molecolari della microglia per lo studio dell’eterogeneità. I progressi nella tecnologia di sequenziamento dell’RNA a singola cellula (RNA-seq) hanno permesso l’identificazione delle caratteristiche molecolari della microglia attivata in condizioni patologiche13. Pertanto, la capacità di isolare le popolazioni cellulari è fondamentale per ulteriori indagini su queste cellule bersaglio in condizioni specifiche.

Gli studi condotti per comprendere le caratteristiche e le funzioni della microglia sono di solito studi in vitro, poiché è stato riscontrato che un gran numero di microglia primarie possono essere preparate e coltivate dal cervello del cucciolo di topo (1-3 giorni), che si attaccano ai palloni di coltura e crescono sulla superficie plastica con altre cellule gliali miste. Successivamente, la microglia pura può essere isolata in base alla diversa adesività delle cellule gliali miste14,15. Tuttavia, questo metodo può solo isolare la microglia dal cervello perinatale e richiede diverse settimane. Le potenziali variabili in coltura cellulare possono influenzare le caratteristiche microgliali come l’espressione molecolare16. Inoltre, le microglia isolate con questi metodi possono partecipare solo a esperimenti in vitro simulando le condizioni delle malattie del SNC e non possono rappresentare le caratteristiche e le funzioni della microglia negli stati di malattia in vivo. Pertanto, è necessario sviluppare metodi per isolare la microglia dal cervello del topo adulto.

Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la separazione magnetica sono due metodi ampiamente utilizzati, sebbene abbiano i loro diversi limiti 16,17,18,19. I loro rispettivi vantaggi e svantaggi saranno contrastati nella sezione di discussione. La maturazione della tecnologia MACS offre la possibilità di purificare rapidamente le cellule. Huang et al. hanno sviluppato un metodo conveniente per etichettare le lesioni demielinizzanti nel cervello20. Combinando questi due approcci tecnici, proponiamo un protocollo di separazione magnetica CD11b colonnare rapido ed efficiente, fornendo una descrizione passo-passo per isolare la microglia attorno a lesioni demielinizzanti nel cervello di topo adulto e preservare le caratteristiche molecolari della microglia. Le lesioni demielinizzanti focali sono state causate dall’iniezione stereotassica di 2 μL di soluzione di lisolecitina (1% LPC in 0,9% NaCl) nel corpo calloso 3 giorni prima di iniziare il protocollo21. Questo protocollo pone le basi per eseguire il passo successivo in esperimenti in vitro. Inoltre, questo protocollo consente di risparmiare tempo e rimane fattibile per un uso diffuso in vari esperimenti.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall’Institute of Animal Care Committee del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Cina. 1. Materiali Preparare le soluzioni seguenti prima di iniziare il protocollo. Preparare il tampone di carico aggiungendo siero bovino fetale (FBS, 2%) alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere colorante rosso neutro (NR) (finale 1%) al PBS. </li…

Representative Results

Le microglia isolate con perline CD11b hanno un’elevata purezzaLe cellule microgliali intorno alle lesioni nei modelli murini di demielinizzazione sono state isolate utilizzando il protocollo sopra menzionato e testate mediante citometria a flusso. Le cellule sono etichettate fluorescentemente con ISOTIOCIANATO CD11b-Fluoresceina (FITC) e CD45-alloficocianina (APC) per determinare la microglia nella citometria a flusso secondo le istruzioni del produttore. Esistono diverse letterature che dimostrano …

Discussion

Il protocollo propone un metodo per isolare la microglia attorno alle lesioni demielinizzanti, che può aiutare a studiare le caratteristiche funzionali della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti. Le microglia catturate utilizzando perline CD11b mostrano un’elevata purezza e vitalità. I passaggi critici del protocollo includono la localizzazione precisa dei fuochi e la purificazione microgliale ottimale. Nella fase di protocollo 2.1, è necessario iniettare la soluzione NR 2 ore prima di sacrificare il…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo studio è stato sostenuto dalla Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).

Materials

1.5 mL Micro Centrifuge Tubes BIOFIL CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011500
70 µm Filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-107-677
C57BL/6J Mice SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse Miltenyi Biotec 130-093-634
Fetal Bovine Serum BOSTER PYG0001
FlowJo BD Biosciences V10
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Neutral Red Sigma-Aldrich 1013690025
NovoCyte Flow Cytometer Agilent A system consisting of various parts
NovoExpress Agilent 1.4.1
PBS BOSTER PYG0021
Pentobarbital Sigma-Aldrich P-010
Stereomicroscope MshOt MZ62

References

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Cite This Article
Zhang, H., Yang, S., Chen, M., Tian, D., Qin, C. Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination. J. Vis. Exp. (182), e63511, doi:10.3791/63511 (2022).

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