Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Mikroglia stammen von Dotter-Sack-Vorläufern, die sehr früh das embryonale Gehirn erreichen und an der Entwicklung des ZNS ^1,2 beteiligt sind. Zum Beispiel sind sie am synaptischen Beschneiden³ und der Regulierung des axonalen Wachstums^{beteiligt 4}. Sie sezernieren Faktoren, die das neuronale Überleben fördern und die neuronale Lokalisation unterstützen⁵. Gleichzeitig sind sie an der Entfernung abnormaler Zellen und apoptotischer Zellen beteiligt, um eine normale Gehirnentwicklung zu gewährleisten⁶. Darüber hinaus überwachen Mikroglia als immunkompetente Zellen des Gehirns kontinuierlich das Gehirnparenchym, um tote Zellen, dysfunktionale Synapsen und Zelltrümmer zu beseitigen⁷. Es wurde gezeigt, dass die Mikrogliaaktivierung eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Krankheiten spielt, einschließlich entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen, neurodegenerativer Erkrankungen und Hirntumoren. Aktivierte Mikroglia bei Multipler Sklerose (MS) tragen zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) und zur Regeneration von Myelin bei, indem sie Myelintrümmer⁸ verschlingen.

Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) aktiviert die Ansammlung von Amyloid-Beta (Aβ) Mikroglia, die die phagozytären und entzündlichen Funktionen der Mikroglia⁹ beeinflusst. Aktivierte Mikroglia im Gliomgewebe, sogenannte Gliom-assoziierte Mikroglia (GAM), können das Fortschreiten des Glioms regulieren und letztendlich die Prognose der Patienten^{beeinflussen 10}. Die Aktivierung verändert das Mikroglia-Transkriptom tiefgreifend, was zu morphologischen Veränderungen, der Expression von Immunrezeptoren, erhöhter phagozytischer Aktivität und einer verbesserten Zytokinsekretion^{führt 11}. Es gibt verschiedene Untergruppen von aktivierten Mikroglia bei neurodegenerativen Erkrankungen wie krankheitsassoziierte Mikroglia (DAM), aktivierte Reaktionsmikroglia (ARM) und mikroglialer neurodegenerativer Phänotyp (MGnD)⁸.

In ähnlicher Weise koexistieren mehrere dynamische funktionelle Untergruppen von Mikroglia auch im Gehirn bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen¹². Das Verständnis der Heterogenität zwischen verschiedenen Untergruppen von Mikroglia ist unerlässlich, um die Pathogenese entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen zu untersuchen und ihre potenziellen therapeutischen Strategien zu finden. Die Heterogenität von Mikroglia hängt hauptsächlich von der molekularen Spezifität^{ab 8}. Es ist wichtig, die molekularen Veränderungen von Mikroglia für die Untersuchung der Heterogenität genau zu beschreiben. Fortschritte in der Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie (RNA-seq) haben die Identifizierung der molekularen Eigenschaften aktivierter Mikroglia unter pathologischen Zuständen^{ermöglicht 13}. Daher ist die Fähigkeit, Zellpopulationen zu isolieren, entscheidend für die weitere Untersuchung dieser Zielzellen unter bestimmten Bedingungen.

Studien, die durchgeführt wurden, um die Eigenschaften und Funktionen von Mikroglia zu verstehen, sind in der Regel In-vitro-Studien, da festgestellt wurde, dass eine große Anzahl von primären Mikroglia aus Mauswelpengehirnen (1-3 Tage alt) hergestellt und kultiviert werden kann, die an den Kulturkolben haften und auf der Kunststoffoberfläche mit anderen gemischten Gliazellen wachsen. Anschließend können reine Mikroglia basierend auf der unterschiedlichen Haftfähigkeit von gemischten Gliazellen^{isoliert werden 14,15}. Diese Methode kann jedoch nur Mikroglia aus dem perinatalen Gehirn isolieren und dauert mehrere Wochen. Potentielle Variablen in der Zellkultur können Mikroglia-Eigenschaften wie die molekulare Expression^{beeinflussen 16}. Darüber hinaus können Mikroglia, die mit diesen Methoden isoliert werden, nur an In-vitro-Experimenten teilnehmen, indem sie die Bedingungen von ZNS-Erkrankungen simulieren, und können die Eigenschaften und Funktionen von Mikroglia in In-vivo-Krankheitszuständen nicht darstellen. Daher ist es notwendig, Methoden zur Isolierung von Mikroglia aus dem erwachsenen Mäusegehirn zu entwickeln.

Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und magnetische Trennung sind zwei weit verbreitete Methoden, obwohl sie ihre eigenen unterschiedlichen Einschränkungen haben^16,17,18,19. Ihre jeweiligen Vor- und Nachteile werden im Diskussionsteil gegenübergestellt. Die Reifung der MACS-Technologie bietet die Möglichkeit, Zellen schnell zu reinigen. Huang et al. haben eine bequeme Methode entwickelt, um demyelinisierende Läsionen im Gehirn^{zu markieren 20}. Durch die Kombination dieser beiden technischen Ansätze schlagen wir ein schnelles und effizientes säulenförmiges magnetisches CD11b-Trennprotokoll vor, das eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung zur Isolierung von Mikroglia um demyelinisierende Läsionen in erwachsenen Mäusegehirnen und die Erhaltung der molekularen Eigenschaften von Mikroglia liefert. Die fokalen demyelinisierenden Läsionen wurden durch die stereotaktische Injektion von 2 μL Lysolecithinlösung (1% LPC in 0,9% NaCl) in das Corpus callosum 3 Tage vor Beginn des Protokolls²¹ verursacht. Dieses Protokoll legt den Grundstein für die Durchführung des nächsten Schritts in In-vitro-Experimenten. Darüber hinaus spart dieses Protokoll Zeit und bleibt für den breiten Einsatz in verschiedenen Experimenten machbar.