Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

A microglia é originária de progenitores de gema-sac, que atingem o cérebro embrionário muito cedo e participam do desenvolvimento do CNS ^1,2. Por exemplo, eles estão envolvidos na poda sináptica³ e na regulação do crescimento axonal⁴. Eles secretam fatores que promovem a sobrevivência neuronal e ajudam a localização neuronal⁵. Ao mesmo tempo, eles estão envolvidos na remoção de células anormais e células apoptóticas para garantir o desenvolvimento cerebral normal⁶. Além disso, como as células imuno-competentes do cérebro, microglia vigia continuamente o parnchyma cerebral para limpar células mortas, sinapses disfuncionais e detritos celulares⁷. Foi demonstrado que a ativação microglial desempenha um papel importante em uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias desmielinizantes, doenças neurodegenerativas e tumores cerebrais. Microglia ativada na esclerose múltipla (EM) contribuem para a diferenciação das células precursoras oligodendrocytos (OPCs) e a regeneração da mielina, engolindo detritos de mielina⁸.

Na doença de Alzheimer (DA), o acúmulo de beta amiloide (Aβ) ativa a microglia, que afeta as funções fagocíticas e inflamatórias da microglia⁹. A microglia ativada no tecido glioma, chamada microglia associada ao glioma (GAM), pode regular a progressão do glioma e, em última instância, afetar o prognóstico dos pacientes¹⁰. A ativação altera profundamente o transcriptome microglial, resultando em alterações morfológicas, expressão de receptores imunológicos, aumento da atividade fagocítica e secreção de^{citocinas aprimorada 11}. Existem diferentes subconjuntos de microglia ativada em doenças neurodegenerativas, como microglia associada à doença (DAM), microglia de resposta ativada (ARM) e fenótipo neurodegenerativo microglial (MGnD)⁸.

Da mesma forma, múltiplos subconjuntos funcionais dinâmicos de microglia também coexistem no cérebro em doenças inflamatórias desmielinizantes¹². Compreender a heterogeneidade entre diferentes subconjuntos de microglia é essencial para investigar a patogênese das doenças inflamatórias desmielinizantes e encontrar suas potenciais estratégias terapêuticas. A heterogeneidade da microglia depende principalmente da especificidade molecular⁸. É essencial descrever as alterações moleculares da microglia com precisão para o estudo da heterogeneidade. Os avanços na tecnologia de sequenciamento de RNA unicelular (RNA-seq) permitiram a identificação das características moleculares da microglia ativada em condições patológicas¹³. Portanto, a capacidade de isolar populações celulares é fundamental para uma investigação mais aprofundada dessas células-alvo em condições específicas.

Estudos realizados para entender as características e funções da microglia são geralmente estudos in vitro, uma vez que se descobriu que um grande número de microglia primária pode ser preparada e cultivada a partir de cérebros de filhotes de camundongos (1-3 dias de idade), que se ligam aos frascos de cultura e crescem na superfície plástica com outras células glias mistas. Posteriormente, a microglia pura pode ser isolada com base naadesividade diferente das células glias mistas^14,15. No entanto, este método só pode isolar a microglia do cérebro perinatal e leva várias semanas. Variáveis potenciais na cultura celular podem influenciar características microgliais, como a expressão molecular¹⁶. Além disso, a microglia isolada por esses métodos só pode participar de experimentos in vitro simulando as condições das doenças do SNC e não pode representar as características e funções da microglia in vivo estados da doença. Portanto, é necessário desenvolver métodos para isolar microglia do cérebro de camundongo adulto.

A triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) e a separação magnética são dois métodos amplamente utilizados, embora tenham suas próprias limitações diferentes 16,17,18,19. Suas respectivas vantagens e desvantagens serão contrastadas na seção de discussão. O amadurecimento da tecnologia MACS oferece a possibilidade de purificar rapidamente as células. Huang et al. desenvolveram um método conveniente para rotular lesões desmielinizando no cérebro²⁰. Combinando essas duas abordagens técnicas, propomos um protocolo de separação magnética CD11b rápido e eficiente, fornecendo uma descrição passo a passo para isolar a microglia em torno de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos adultos e preservar as características moleculares da microglia. As lesões desmielinizadores focais foram causadas pela injeção estereotática de 2 μL de solução de lisolecithin (1% LPC em 0,9% NaCl) no calosum do corpus 3 dias antes de iniciar o protocolo²¹. Este protocolo estabelece as bases para realizar o próximo passo em experimentos in vitro. Além disso, este protocolo economiza tempo e permanece viável para uso generalizado em vários experimentos.