Summary

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Published: April 05, 2022
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Abstract

Microglia, as células imunes inatas residentes no cérebro, são os respondentes primários para inflamação ou lesão no sistema nervoso central (SNC). A microglia pode ser dividida em estado de repouso e estado ativado e pode mudar rapidamente o estado em resposta ao microambiente do cérebro. A microglia será ativada em diferentes condições patológicas e apresentará diferentes fenótipos. Além disso, existem muitos subgrupos diferentes de microglia ativada e grande heterogeneidade entre diferentes subgrupos. A heterogeneidade depende principalmente da especificidade molecular da microglia. Estudos revelaram que a microglia será ativada e desempenhará um papel importante no processo patológico da desmielinização inflamatória. Para entender melhor as características da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias, como esclerose múltipla e distúrbio do espectro neuromielite optica, propomos um protocolo de triagem microglial primária perilesional. Este protocolo utiliza a triagem celular ativada por colunaar (MACS) para obter microglia primária altamente purificada e preservar as características moleculares da microglia para investigar os efeitos potenciais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias.

Introduction

A microglia é originária de progenitores de gema-sac, que atingem o cérebro embrionário muito cedo e participam do desenvolvimento do CNS 1,2. Por exemplo, eles estão envolvidos na poda sináptica3 e na regulação do crescimento axonal4. Eles secretam fatores que promovem a sobrevivência neuronal e ajudam a localização neuronal5. Ao mesmo tempo, eles estão envolvidos na remoção de células anormais e células apoptóticas para garantir o desenvolvimento cerebral normal6. Além disso, como as células imuno-competentes do cérebro, microglia vigia continuamente o parnchyma cerebral para limpar células mortas, sinapses disfuncionais e detritos celulares7. Foi demonstrado que a ativação microglial desempenha um papel importante em uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias desmielinizantes, doenças neurodegenerativas e tumores cerebrais. Microglia ativada na esclerose múltipla (EM) contribuem para a diferenciação das células precursoras oligodendrocytos (OPCs) e a regeneração da mielina, engolindo detritos de mielina8.

Na doença de Alzheimer (DA), o acúmulo de beta amiloide (Aβ) ativa a microglia, que afeta as funções fagocíticas e inflamatórias da microglia9. A microglia ativada no tecido glioma, chamada microglia associada ao glioma (GAM), pode regular a progressão do glioma e, em última instância, afetar o prognóstico dos pacientes10. A ativação altera profundamente o transcriptome microglial, resultando em alterações morfológicas, expressão de receptores imunológicos, aumento da atividade fagocítica e secreção decitocinas aprimorada 11. Existem diferentes subconjuntos de microglia ativada em doenças neurodegenerativas, como microglia associada à doença (DAM), microglia de resposta ativada (ARM) e fenótipo neurodegenerativo microglial (MGnD)8.

Da mesma forma, múltiplos subconjuntos funcionais dinâmicos de microglia também coexistem no cérebro em doenças inflamatórias desmielinizantes12. Compreender a heterogeneidade entre diferentes subconjuntos de microglia é essencial para investigar a patogênese das doenças inflamatórias desmielinizantes e encontrar suas potenciais estratégias terapêuticas. A heterogeneidade da microglia depende principalmente da especificidade molecular8. É essencial descrever as alterações moleculares da microglia com precisão para o estudo da heterogeneidade. Os avanços na tecnologia de sequenciamento de RNA unicelular (RNA-seq) permitiram a identificação das características moleculares da microglia ativada em condições patológicas13. Portanto, a capacidade de isolar populações celulares é fundamental para uma investigação mais aprofundada dessas células-alvo em condições específicas.

Estudos realizados para entender as características e funções da microglia são geralmente estudos in vitro, uma vez que se descobriu que um grande número de microglia primária pode ser preparada e cultivada a partir de cérebros de filhotes de camundongos (1-3 dias de idade), que se ligam aos frascos de cultura e crescem na superfície plástica com outras células glias mistas. Posteriormente, a microglia pura pode ser isolada com base naadesividade diferente das células glias mistas14,15. No entanto, este método só pode isolar a microglia do cérebro perinatal e leva várias semanas. Variáveis potenciais na cultura celular podem influenciar características microgliais, como a expressão molecular16. Além disso, a microglia isolada por esses métodos só pode participar de experimentos in vitro simulando as condições das doenças do SNC e não pode representar as características e funções da microglia in vivo estados da doença. Portanto, é necessário desenvolver métodos para isolar microglia do cérebro de camundongo adulto.

A triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) e a separação magnética são dois métodos amplamente utilizados, embora tenham suas próprias limitações diferentes 16,17,18,19. Suas respectivas vantagens e desvantagens serão contrastadas na seção de discussão. O amadurecimento da tecnologia MACS oferece a possibilidade de purificar rapidamente as células. Huang et al. desenvolveram um método conveniente para rotular lesões desmielinizando no cérebro20. Combinando essas duas abordagens técnicas, propomos um protocolo de separação magnética CD11b rápido e eficiente, fornecendo uma descrição passo a passo para isolar a microglia em torno de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos adultos e preservar as características moleculares da microglia. As lesões desmielinizadores focais foram causadas pela injeção estereotática de 2 μL de solução de lisolecithin (1% LPC em 0,9% NaCl) no calosum do corpus 3 dias antes de iniciar o protocolo21. Este protocolo estabelece as bases para realizar o próximo passo em experimentos in vitro. Além disso, este protocolo economiza tempo e permanece viável para uso generalizado em vários experimentos.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China. 1. Materiais Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo. Prepare o tampão de carga adicionando soro bovino fetal (FBS, 2%) à solução salina tamponada de fosfato (PBS). Adicione corante vermelho neutro (NR) (1%) final ao PBS. Prepare as seguin…

Representative Results

Microglia isolada usando contas CD11b têm alta purezaAs células microgliais ao redor das lesões em modelos de camundongos desmielinização foram isoladas usando o protocolo acima mencionado e testadas por citometria de fluxo. As células são rotuladas fluorescentemente com isothiocyanato cd11b-fluoresceína (FITC) e CD45-alophycocyanin (APC) para determinar microglia na citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante. Existem várias literaturas demonstrando que os anticorpos CD1…

Discussion

O protocolo propõe um método para isolar a microglia em torno das lesões desmielinizantes, que podem ajudar a estudar as características funcionais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias. Microglia capturadas usando contas CD11b exibem alta pureza e viabilidade. As etapas críticas do protocolo incluem a localização precisa de focos e a purificação microglial ideal. No protocolo passo 2.1, é necessário injetar a solução NR 2 h antes de sacrificar o mouse para garantir que as lesões possam s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O estudo foi apoiado pela Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).

Materials

1.5 mL Micro Centrifuge Tubes BIOFIL CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011500
70 µm Filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-107-677
C57BL/6J Mice SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse Miltenyi Biotec 130-093-634
Fetal Bovine Serum BOSTER PYG0001
FlowJo BD Biosciences V10
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Neutral Red Sigma-Aldrich 1013690025
NovoCyte Flow Cytometer Agilent A system consisting of various parts
NovoExpress Agilent 1.4.1
PBS BOSTER PYG0021
Pentobarbital Sigma-Aldrich P-010
Stereomicroscope MshOt MZ62

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).

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Cite This Article
Zhang, H., Yang, S., Chen, M., Tian, D., Qin, C. Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination. J. Vis. Exp. (182), e63511, doi:10.3791/63511 (2022).

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