Выделение первичной микроглии мыши методом магнитно-активированной сортировки клеток на животных моделях демиелинизации

Микроглии происходят из желточно-мешочных прародителей, которые достигают эмбрионального мозга очень рано и участвуют в развитии ЦНС ^1,2. Например, они участвуют в синаптической обрезке³ и регуляции роста аксонов⁴. Они выделяют факторы, которые способствуют выживанию нейронов и помогают локализации нейронов⁵. В то же время они участвуют в удалении аномальных клеток и апоптотических клеток для обеспечения нормального развития мозга⁶. Кроме того, как иммунокомпетентные клетки мозга, микроглия постоянно наблюдает за паренхимой мозга, чтобы очистить мертвые клетки, дисфункциональные синапсы и клеточный мусор⁷. Было продемонстрировано, что активация микроглии играет важную роль при различных заболеваниях, включая воспалительные демиелинизирующие заболевания, нейродегенеративные заболевания и опухоли головного мозга. Активированные микроглии при рассеянном склерозе (РС) способствуют дифференцировке клеток-предшественников олигодендроцитов (ОПК) и регенерации миелина путем поглощения миелиновых остатков⁸.

При болезни Альцгеймера (БА) накопление бета-амилоида (Aβ) активирует микроглию, которая влияет на фагоцитарные и воспалительные функции микроглии⁹. Активированная микроглия в ткани глиомы, называемая глиома-ассоциированной микроглией (GAM), может регулировать прогрессирование глиомы и в конечном итоге влиять на прогноз пациентов¹⁰. Активация глубоко изменяет транскриптом микроглии, что приводит к морфологическим изменениям, экспрессии иммунных рецепторов, повышению фагоцитарной активности и усилению секреции цитокинов¹¹. Существуют различные подмножества активированной микроглии при нейродегенеративных заболеваниях, таких как ассоциированная с заболеванием микроглия (DAM), микроглия с активированным ответом (ARM) и микроглиальный нейродегенеративный фенотип (MGnD)⁸.

Аналогичным образом, множественные динамические функциональные подмножества микроглии также сосуществуют в головном мозге при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях¹². Понимание неоднородности между различными подмножествами микроглии имеет важное значение для исследования патогенеза воспалительных демиелинизирующих заболеваний и поиска их потенциальных терапевтических стратегий. Гетерогенность микроглии в основном зависит от молекулярной специфичности⁸. Важно точно описать молекулярные изменения микроглии для изучения неоднородности. Достижения в технологии одноклеточного РНК-секвенирования (RNA-seq) позволили идентифицировать молекулярные характеристики активированной микроглии в патологических состояниях¹³. Поэтому способность изолировать клеточные популяции имеет решающее значение для дальнейшего исследования этих клеток-мишеней в определенных условиях.

Исследования, проводимые для понимания характеристик и функций микроглии, обычно являются исследованиями in vitro, поскольку было обнаружено, что большое количество первичной микроглии может быть получено и культивировано из мозга щенка мыши (1-3 дня), которые прикрепляются к колбам культуры и растут на пластиковой поверхности с другими смешанными глиальными клетками. Впоследствии чистую микроглию можно выделить на основе различной адгезивности смешанных глиальных клеток^14,15. Однако этот метод позволяет изолировать микроглию только от перинатального мозга и занимает несколько недель. Потенциальные переменные в клеточной культуре могут влиять на характеристики микроглии, такие как молекулярная экспрессия¹⁶. Более того, микроглия, выделенная этими методами, может участвовать в экспериментах in vitro только путем моделирования состояний заболеваний ЦНС и не может представлять характеристики и функции микроглии в болезненных состояниях in vivo. Поэтому необходимо разработать методы выделения микроглии из мозга взрослой мыши.

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитная сепарация являются двумя широко используемыми методами, хотя они имеют свои собственные различные ограничения 16,17,18,19. Их соответствующие преимущества и недостатки будут противопоставлены в разделе обсуждения. Созревание технологии MACS дает возможность быстрой очистки клеток. Huang et al. разработали удобный метод маркировки демиелинизирующих поражений в мозге²⁰. Объединив эти два технических подхода, мы предлагаем быстрый и эффективный столбчатый протокол магнитного разделения CD11b, обеспечивающий пошаговое описание для выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений в мозге взрослых мышей и сохранения молекулярных характеристик микроглии. Очаговые демиелинизирующие поражения были вызваны стереотаксическим введением 2 мкл раствора лизолецитина (1% LPC в 0,9% NaCl) в мозолистое тело за 3 дня до начала протокола²¹. Этот протокол закладывает основу для выполнения следующего шага в экспериментах in vitro. Более того, этот протокол экономит время и остается осуществимым для широкого использования в различных экспериментах.