Summary

Выделение первичной микроглии мыши методом магнитно-активированной сортировки клеток на животных моделях демиелинизации

Published: April 05, 2022
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол для выделения и очистки первичной микроглии на животных моделях демиелинизирующих заболеваний с использованием столбчатой магнитно-активированной сортировки клеток.

Abstract

Микроглия, резидентные врожденные иммунные клетки в мозге, являются основными ответчиками на воспаление или травму в центральной нервной системе (ЦНС). Микроглия может быть разделена на состояние покоя и активированное состояние и может быстро менять состояние в ответ на микроокружение мозга. Микроглия будет активироваться при разных патологических состояниях и проявлять разные фенотипы. Кроме того, существует множество различных подгрупп активированной микроглии и большая неоднородность между различными подгруппами. Гетерогенность в основном зависит от молекулярной специфичности микроглии. Исследования выявили, что микроглия будет активироваться и играть важную роль в патологическом процессе воспалительной демиелинизации. Чтобы лучше понять характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз и расстройство зрительного спектра нейромиелита, мы предлагаем протокол перилезной первичной сортировки микроглии. Этот протокол использует столбчатую магнитно-активированную сортировку клеток (MACS) для получения высокоочищенной первичной микроглии и сохранения молекулярных характеристик микроглии для исследования потенциальных эффектов микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях.

Introduction

Микроглии происходят из желточно-мешочных прародителей, которые достигают эмбрионального мозга очень рано и участвуют в развитии ЦНС 1,2. Например, они участвуют в синаптической обрезке3 и регуляции роста аксонов4. Они выделяют факторы, которые способствуют выживанию нейронов и помогают локализации нейронов5. В то же время они участвуют в удалении аномальных клеток и апоптотических клеток для обеспечения нормального развития мозга6. Кроме того, как иммунокомпетентные клетки мозга, микроглия постоянно наблюдает за паренхимой мозга, чтобы очистить мертвые клетки, дисфункциональные синапсы и клеточный мусор7. Было продемонстрировано, что активация микроглии играет важную роль при различных заболеваниях, включая воспалительные демиелинизирующие заболевания, нейродегенеративные заболевания и опухоли головного мозга. Активированные микроглии при рассеянном склерозе (РС) способствуют дифференцировке клеток-предшественников олигодендроцитов (ОПК) и регенерации миелина путем поглощения миелиновых остатков8.

При болезни Альцгеймера (БА) накопление бета-амилоида (Aβ) активирует микроглию, которая влияет на фагоцитарные и воспалительные функции микроглии9. Активированная микроглия в ткани глиомы, называемая глиома-ассоциированной микроглией (GAM), может регулировать прогрессирование глиомы и в конечном итоге влиять на прогноз пациентов10. Активация глубоко изменяет транскриптом микроглии, что приводит к морфологическим изменениям, экспрессии иммунных рецепторов, повышению фагоцитарной активности и усилению секреции цитокинов11. Существуют различные подмножества активированной микроглии при нейродегенеративных заболеваниях, таких как ассоциированная с заболеванием микроглия (DAM), микроглия с активированным ответом (ARM) и микроглиальный нейродегенеративный фенотип (MGnD)8.

Аналогичным образом, множественные динамические функциональные подмножества микроглии также сосуществуют в головном мозге при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях12. Понимание неоднородности между различными подмножествами микроглии имеет важное значение для исследования патогенеза воспалительных демиелинизирующих заболеваний и поиска их потенциальных терапевтических стратегий. Гетерогенность микроглии в основном зависит от молекулярной специфичности8. Важно точно описать молекулярные изменения микроглии для изучения неоднородности. Достижения в технологии одноклеточного РНК-секвенирования (RNA-seq) позволили идентифицировать молекулярные характеристики активированной микроглии в патологических состояниях13. Поэтому способность изолировать клеточные популяции имеет решающее значение для дальнейшего исследования этих клеток-мишеней в определенных условиях.

Исследования, проводимые для понимания характеристик и функций микроглии, обычно являются исследованиями in vitro, поскольку было обнаружено, что большое количество первичной микроглии может быть получено и культивировано из мозга щенка мыши (1-3 дня), которые прикрепляются к колбам культуры и растут на пластиковой поверхности с другими смешанными глиальными клетками. Впоследствии чистую микроглию можно выделить на основе различной адгезивности смешанных глиальных клеток14,15. Однако этот метод позволяет изолировать микроглию только от перинатального мозга и занимает несколько недель. Потенциальные переменные в клеточной культуре могут влиять на характеристики микроглии, такие как молекулярная экспрессия16. Более того, микроглия, выделенная этими методами, может участвовать в экспериментах in vitro только путем моделирования состояний заболеваний ЦНС и не может представлять характеристики и функции микроглии в болезненных состояниях in vivo. Поэтому необходимо разработать методы выделения микроглии из мозга взрослой мыши.

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитная сепарация являются двумя широко используемыми методами, хотя они имеют свои собственные различные ограничения 16,17,18,19. Их соответствующие преимущества и недостатки будут противопоставлены в разделе обсуждения. Созревание технологии MACS дает возможность быстрой очистки клеток. Huang et al. разработали удобный метод маркировки демиелинизирующих поражений в мозге20. Объединив эти два технических подхода, мы предлагаем быстрый и эффективный столбчатый протокол магнитного разделения CD11b, обеспечивающий пошаговое описание для выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений в мозге взрослых мышей и сохранения молекулярных характеристик микроглии. Очаговые демиелинизирующие поражения были вызваны стереотаксическим введением 2 мкл раствора лизолецитина (1% LPC в 0,9% NaCl) в мозолистое тело за 3 дня до начала протокола21. Этот протокол закладывает основу для выполнения следующего шага в экспериментах in vitro. Более того, этот протокол экономит время и остается осуществимым для широкого использования в различных экспериментах.

Protocol

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом института по уходу за животными Медицинского колледжа Тунцзи, Университет науки и технологии Хуачжун, Китай. 1. Материалы Подготовьте следующие решения перед началом протокола. Подготовьте нагрузочн?…

Representative Results

Микроглия, выделенная с использованием шариков CD11b, имеет высокую чистотуМикроглиальные клетки вокруг поражений в моделях демиелинизации мышей были выделены с использованием вышеупомянутого протокола и протестированы с помощью проточной цитометрии. Клетки флуоресцентно…

Discussion

Протокол предлагает метод выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений, который может помочь изучить функциональные характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях. Микроглия, отловленная с помощью шариков CD11b, отличается высокой чистотой и жи…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследование было поддержано Фондом выдающихся молодых ученых больницы Тунцзи (HUST) (грант No 2020YQ06).

Materials

1.5 mL Micro Centrifuge Tubes BIOFIL CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011500
70 µm Filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-107-677
C57BL/6J Mice SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse Miltenyi Biotec 130-093-634
Fetal Bovine Serum BOSTER PYG0001
FlowJo BD Biosciences V10
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Neutral Red Sigma-Aldrich 1013690025
NovoCyte Flow Cytometer Agilent A system consisting of various parts
NovoExpress Agilent 1.4.1
PBS BOSTER PYG0021
Pentobarbital Sigma-Aldrich P-010
Stereomicroscope MshOt MZ62

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, H., Yang, S., Chen, M., Tian, D., Qin, C. Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination. J. Vis. Exp. (182), e63511, doi:10.3791/63511 (2022).

View Video