Summary

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

Published: April 05, 2022
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

Abstract

מיקרוגליה, תאי החיסון המולדים במוח, הם המגיבים העיקריים לדלקת או לפציעה במערכת העצבים המרכזית (CNS). ניתן לחלק את המיקרוגליה למצב מנוחה ולמצב מופעל והוא יכול לשנות את המצב במהירות בתגובה למיקרו-סביבה של המוח. מיקרוגליה תופעל בתנאים פתולוגיים שונים ותציג פנוטיפים שונים. בנוסף, ישנן תת-קבוצות רבות ושונות של מיקרוגליה מופעלת והטרוגניות רבה בין תת-קבוצות שונות. ההטרוגניות תלויה בעיקר בייחודיות המולקולרית של המיקרוגליה. מחקרים גילו כי מיקרוגליה תופעל ותמלא תפקיד חשוב בתהליך הפתולוגי של דמילינציה דלקתית. כדי להבין טוב יותר את המאפיינים של מיקרוגליה במחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה והפרעת ספקטרום נוירומיאליטיס אופטיקה, אנו מציעים פרוטוקול מיון מיקרוגליאלי ראשוני. פרוטוקול זה משתמש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטית טוררית (MACS) כדי להשיג מיקרוגליה ראשונית מטוהרת מאוד ולשמר את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של מיקרוגליה במחלות דלקתיות.

Introduction

מקורם של המיקרוגליה הוא באבות חלמון-שק, המגיעים למוח העוברי מוקדם מאוד ומשתתפים בפיתוח מערכת העצבים המרכזית 1,2. לדוגמה, הם מעורבים בגיזום סינפטי3 ובוויסות הצמיחה האקסונלית4. הם מפרישים גורמים המקדמים הישרדות עצבית ומסייעים ללוקליזציה עצבית5. במקביל, הם מעורבים בהסרת תאים לא תקינים ותאים אפופטוטיים כדי להבטיח התפתחותמוחית תקינה 6. בנוסף, ככל שהתאים הכשירים לחיסון של המוח, מיקרוגליה חושפת ללא הרף את הפרנכימה המוחית כדי לנקות תאים מתים, סינפסות לא מתפקדות ופסולת תאית7. הוכח כי הפעלה מיקרוגליאלית ממלאת תפקיד חשוב במגוון מחלות, כולל מחלות דלקתיות, מחלות נוירודגנרטיביות וגידולי מוח. מיקרוגליה מופעלת בטרשת נפוצה (MS) תורמת להתמיינות של תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים (OPCs) ולהתחדשות של מיאלין על ידי בליעת פסולת מיאלין8.

במחלת אלצהיימר (AD), הצטברות של עמילואיד בטא (Aβ) מפעילה מיקרוגליה, המשפיעה על התפקודים הפאגוציטיים והדלקתיים של מיקרוגליה9. מיקרוגליה מופעלת ברקמת הגליומה, הנקראת מיקרוגליה הקשורה לגליומה (GAM), יכולה לווסת את התקדמות הגליומה ובסופו של דבר להשפיע על הפרוגנוזה של חולים10. ההפעלה משנה באופן עמוק את השעתוק המיקרוגליאלי, וכתוצאה מכך שינויים מורפולוגיים, ביטוי של קולטני מערכת החיסון, פעילות פגוציטית מוגברת והפרשת ציטוקיניםמשופרת 11. ישנן תת-קבוצות שונות של מיקרוגליה מופעלת במחלות נוירודגנרטיביות כגון מיקרוגליה הקשורה למחלה (DAM), מיקרוגליה בתגובה פעילה (ARM) ופנוטיפ נוירודגנרטיבי מיקרוגליאלי (MGnD)8.

באופן דומה, תת-קבוצות תפקודיות דינמיות מרובות של מיקרוגליה מתקיימות גם הן יחד במוח במחלות דלקתיות12. הבנת ההטרוגניות בין תת-קבוצות שונות של מיקרוגליה חיונית כדי לחקור את הפתוגנזה של מחלות דלקתיות ולמצוא את האסטרטגיות הטיפוליות הפוטנציאליות שלהן. ההטרוגניות של המיקרוגליה תלויה בעיקר בייחודיות המולקולרית8. חיוני לתאר את השינויים המולקולריים של המיקרוגליה במדויק לחקר ההטרוגניות. ההתקדמות בטכנולוגיית ריצוף ה-RNA החד-תאי (RNA-seq) אפשרה לזהות את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה פעילה בתנאים פתולוגיים13. לכן, היכולת לבודד אוכלוסיות תאים היא קריטית להמשך חקירה של תאי המטרה האלה בתנאים ספציפיים.

מחקרים שבוצעו כדי להבין את המאפיינים והתפקודים של מיקרוגליה הם בדרך כלל מחקרים במבחנה, שכן נמצא כי מספר גדול של מיקרוגליה ראשונית ניתן להכין ולתרבת ממוחות של גורים עכברים (בני 1-3 ימים), אשר מתחברים לצלוחיות התרבית וגדלים על משטח הפלסטיק עם תאי גליה מעורבים אחרים. לאחר מכן, ניתן לבודד מיקרוגליה טהורה על סמך ההדבקה השונה של תאי גליה מעורבים14,15. עם זאת, שיטה זו יכולה רק לבודד מיקרוגליה מהמוח הפרינטלי ונמשכת מספר שבועות. משתנים פוטנציאליים בתרבית תאים עשויים להשפיע על מאפיינים מיקרוגליאליים כגון ביטוי מולקולרי16. יתר על כן, מיקרוגליה המבודדת בשיטות אלה יכולה להשתתף רק בניסויים במבחנה על ידי הדמיית התנאים של מחלות CNS ואינה יכולה לייצג את המאפיינים והתפקודים של מיקרוגליה במצבי מחלה in vivo. לכן, יש צורך לפתח שיטות לבידוד מיקרוגליה ממוח העכבר הבוגר.

מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) והפרדה מגנטית הם שתי שיטות בשימוש נרחב, אם כי יש להם מגבלות שונות משלהם 16,17,18,19. היתרונות והחסרונות שלהם בהתאמה יהיו מנוגדים בסעיף הדיון. ההבשלה של טכנולוגיית MACS מציעה את האפשרות לטהר במהירות תאים. Huang et al. פיתחו שיטה נוחה לתיוג נגעים demyelinating במוח20. בשילוב שתי הגישות הטכניות הללו, אנו מציעים פרוטוקול הפרדה מגנטית מהיר ויעיל CD11b, המספק תיאור שלב אחר שלב כדי לבודד את המיקרוגליה סביב נגעים מתפרקים במוחות של עכברים בוגרים ולשמר את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה. נגעי הדמילינאט המוקד נגרמו על ידי הזרקה סטריאוטקטית של 2 μL של תמיסת ליזולצית’ין (1% LPC ב-0.9% NaCl) בקורפוס קלוסום 3 ימים לפני תחילת הפרוטוקול21. פרוטוקול זה מניח את היסודות לביצוע השלב הבא בניסויים במבחנה. יתר על כן, פרוטוקול זה חוסך זמן ונשאר אפשרי לשימוש נרחב בניסויים שונים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של המכון לטיפול בבעלי חיים של המכללה הרפואית טונגג’י, אוניברסיטת הואז’ונג למדע וטכנולוגיה, סין. 1. חומרים הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול. הכינו את מאגר ההעמסה על ידי הוספת סרום בקר עובר…

Representative Results

מיקרוגליה מבודדת באמצעות חרוזי CD11b בעלי טוהר גבוהתאים מיקרוגליאליים סביב הנגעים במודלים של עכברי דמילינציה בודדו באמצעות הפרוטוקול הנ”ל ונבדקו על ידי ציטומטריה של זרימה. התאים מסומנים באופן פלואורסצנטי עם CD11b-פלואורסציין איזותיוציאנט (FITC) ו-CD45-אלופיקוקיאנין (APC) כדי לקבוע מיקר…

Discussion

הפרוטוקול מציע שיטה לבודד מיקרוגליה סביב נגעי demyelinating, אשר יכול לעזור לחקור את המאפיינים הפונקציונליים של microglia במחלות demyelinating דלקתיות. מיקרוגליה שצולמה באמצעות חרוזי CD11b מפגינה טוהר וכדאיות גבוהים. שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים לוקליזציה מדויקת של מוקדים וטיהור מיקרוגליאלי אופטימלי. ב…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי קרן בית החולים טונג’י (HUST) למדען צעיר מעולה (מענק מס ‘2020YQ06).

Materials

1.5 mL Micro Centrifuge Tubes BIOFIL CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011500
70 µm Filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-107-677
C57BL/6J Mice SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse Miltenyi Biotec 130-093-634
Fetal Bovine Serum BOSTER PYG0001
FlowJo BD Biosciences V10
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Neutral Red Sigma-Aldrich 1013690025
NovoCyte Flow Cytometer Agilent A system consisting of various parts
NovoExpress Agilent 1.4.1
PBS BOSTER PYG0021
Pentobarbital Sigma-Aldrich P-010
Stereomicroscope MshOt MZ62

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, H., Yang, S., Chen, M., Tian, D., Qin, C. Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination. J. Vis. Exp. (182), e63511, doi:10.3791/63511 (2022).

View Video