Summary

Mitokondriyal Disfonksiyonu Incelemek İçin In Vitro Bir Yaklaşım: Bir Cybrid Modeli

Published: March 09, 2022
doi:

Summary

Transmitokondrial sibridler, mitokondriyal DNA (mtDNA) tükenmiş hücrelerin (rho0 hücreleri) mitokondriyal bozukluklardan etkilenen hastalardan türetilen sitoplastlarla (enüklee hücreler) kaynaştırılmasıyla elde edilen melez hücrelerdir. Hastalığın nükleer veya mitokondriyal kökeninin belirlenmesine, biyokimyasal aktivitenin değerlendirilmesine ve mtDNA ile ilişkili varyantların patogenetik rolünün doğrulanmasına izin verir.

Abstract

Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) gerçekleştiren mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin eksikliği, insan mitokondriyal bozukluklarının biyokimyasal belirtecidir. Genetik açıdan bakıldığında, OXPHOS benzersiz bir örneği temsil eder, çünkü iki farklı genetik sistemin tamamlanmasından kaynaklanır: nükleer DNA (nDNA) ve mitokondriyal DNA (mtDNA). Bu nedenle, OXPHOS defektleri nükleer ve mitokondriyal kodlu genleri etkileyen mutasyonlardan kaynaklanabilir.

King ve Attardi’nin 1989’da yayınlanan çığır açan çalışması, mtDNA’dan (rho0 olarak adlandırılan) tükenmiş insan hücre hatlarının, sözde “transmitokondrial sibridler” elde etmek için eksojen mitokondri ile yeniden doldurulabileceğini gösterdi. Mitokondriyal bozuklukları (MD’ler) olan hastalardan ve rho0 hücrelerinden çekirdeklerden türetilen mitokondri içeren bu sibridler sayesinde, bir kusurun mtDNA veya nDNA ile ilişkili olup olmadığını doğrulamak mümkündür. Bu sibridler ayrıca bir mutasyonun patojenitesini doğrulamak ve biyokimyasal düzeyde etkisini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu yazıda sibrid üretimi, seçimi ve karakterizasyonunu açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Introduction

Mitokondriyal bozukluklar (MD’ler), nükleer (nDNA) veya mitokondriyal (mtDNA) DNA1’deki mutasyonlara bağlı mitokondriyal fonksiyonlardaki bozulmanın neden olduğu bir grup multisistem sendromudur. En sık görülen kalıtsal metabolik hastalıklar arasındadır ve prevalansı 1:5.000’dir. mtDNA ile ilişkili hastalıklar mitokondriyal genetik kurallarını izler: maternal kalıtım, heteroplazmi ve eşik etkisi ve mitotik ayrışma2. İnsan mtDNA’sı, replikasyon ve transkripsiyon için gerekli diziler, 13 protein kodlayan gen (solunum zincirinin tüm alt birimleri), 22 tRNA ve 2 rRNAgeni 3 içeren kısa bir kontrol bölgesi içeren 16.6 kb’lik çift sarmallı bir DNA çemberidir.

Sağlıklı bireylerde, patolojik koşullarda tek bir mtDNA genotipi (homoplazmi) bulunurken, birden fazla genotip (heteroplazmi) bir arada bulunur. Zararlı heteroplazmik mutasyonlar, OXPHOS’u bozmak ve4 yaşında herhangi bir organı etkileyebilecek hastalıklara neden olmak için kritik bir eşiğin üstesinden gelmelidir. OXPHOS’un ikili genetiği kalıtımı belirler: nDNA mutasyonları için otozomal resesif veya baskın ve X’e bağlı, mtDNA mutasyonları için anne, artı hem nDNA hem de mtDNA için sporadik vakalar.

Mitokondriyal tıp çağının başlangıcında, King ve Attardi5 tarafından yapılan bir dönüm noktası deneyi, mtDNA’nın tamamen tükendiği tümör hücre hatlarından (rho0 hücreleri) çekirdek içeren hibrit hücreler ve MD’li hastalardan mitokondri içeren hibrit hücreler yaratarak bir MD’den sorumlu bir mutasyonun kökenini anlamak için temel oluşturdu. ve nükleer veya mitokondriyal genomda bir mutasyonun mevcut olup olmadığını belirlemek kolay değildi. 1989’da tanımlanan yöntem daha sonra mitokondriyal tıp alanında çalışan birkaç araştırmacı tarafından kullanıldı 6,7,8,9; 10 yakın zamanda ayrıntılı bir protokol yayınlandı, ancak henüz bir video yapılmadı. NGS’nin bir mutasyonun nerede olduğunu kesin ve hızlı bir şekilde tanımlayabildiği günümüzde böyle bir protokol neden geçerli olmalıdır? Cevap, cybrid üretiminin, herhangi bir yeni mtDNA mutasyonunun patojenik rolünü anlamak, heteroplazmi yüzdesini hastalığın ciddiyeti ile ilişkilendirmek ve hastanın otokton nükleer arka planının katkısının bulunmadığı homojen bir nükleer sistemde biyokimyasal bir araştırma yapmak için hala en gelişmiş protokol olmasıdır11, 12,13.

Bu protokol, 35 mm Petri kaplarında yetiştirilen birleşik, hasta kaynaklı fibroblastlardan sitoplastların nasıl elde edileceğini açıklar. Çanakların sitoçalasin B varlığında santrifüjlenmesi, daha sonra polietilen glikol (PEG) varlığında rho0 hücreleri ile kaynaştırılan enüklee sitoplastların izolasyonuna izin verir. Elde edilen sibridler daha sonra klonlar ortaya çıkana kadar seçici ortamda yetiştirilir. Temsili sonuçlar bölümü, mtDNA’nın donör hastaların fibroblastlarınınkiyle aynı olduğunu ve nDNA’nın tümöral rho0 hücre hattının nükleer DNA’sı ile aynı olduğunu kanıtlamak için ortaya çıkan sibridlerin moleküler karakterizasyonunun bir örneğini göstermektedir.

Protocol

NOT: İnsan fibroblastlarının kullanımı etik onay gerektirebilir. Bu çalışmada kullanılan fibroblastlar MD hastalarından türetilmiş ve etik gerekliliklere uygun olarak Kurumsal biyobankada saklanmıştır. Hücrelerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam verildi. Tüm hücre kültürü prosedürlerini steril laminer akış kabini altında oda sıcaklığında (RT, 22-25 °C) gerçekleştirin. Hücre kültürü ve steril ekipmanlar için uygun steril filtrelenmiş çözeltiler kullanın. Nemlendirilmiş bir…

Representative Results

Sibrid üretmek, 3 günlük laboratuvar çalışması artı bir seçim süresi (~ 2 hafta) ve klonların büyümesi için ek 1-2 hafta gerektirir. Kritik adımlar sitoplastların kalitesi ve seçim dönemidir. Sibridlerin morfolojisi rho0 donör hücrelerininkine benzer. Hücrelerin kimliğini doğrulamak için sibridlerde doğru mtDNA ve nDNA’nın atanması zorunludur. Örnek Şekil 2’de verilmiştir. Bu durumda, mitokondriyal miyopati, ensefalopati, laktik asidoz ve inme benzeri…

Discussion

mtDNA, koruyucu histonların eksikliği ve solunum zincirine yakın konumu nedeniyle nDNA’ya kıyasla çok yüksek bir mutasyon oranına sahiptir, bu da molekülü onarım sistemleri tarafından verimli bir şekilde karşı konulamayan zararlı oksidatif etkilere maruz bırakır16. İlk patojenik mtDNA mutasyonları 1988’de17,18 olarak tanımlandı ve o zamandan beri çok sayıda mutasyon tanımlandı. NGS teknolojisi, tüm mitokondriyal g…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Mariani Vakfı tarafından finanse edilen Mitokondriyal Çocuk Hastalıkları Çalışmaları Merkezi’nde (http://www.mitopedia.org) gerçekleştirilmiştir. VT, Nadir Nöromüsküler Hastalıklar için Avrupa Referans Ağı’nın (ERN EURO-NMD) bir üyesidir.

Materials

5-Bromo-2'-Deoxyuridine Sigma-Aldrich (Merck) B5002-500MG
6 well Plates Corning 3516
96 well Plates Corning 3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit QIAGEN 13323
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL Beckman Coulter 356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea Sigma-Aldrich (Merck) C2743-200UL
Dialyzed FBS Gibco 26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) EuroClone ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) EuroClone ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous Carlo Erba 414601
FetalClone III (Bovine Serum Product) Cytiva – HyClone Laboratories SH30109.03
Glass pasteur pipettes VWR M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy Nikon ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor Beckman Coulter 339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770 Labotech 29960014
L-Glutamine 200 mM (100x) EuroClone ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM Euroclone ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution) Sigma-Aldrich (Merck) P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x) EuroClone ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm EuroClone ET2100
Primo TC Dishes 35 mm EuroClone ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM EuroClone ECM0542D
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS EuroClone ECB3051D
Uridine Sigma-Aldrich (Merck) U3003-5G

References

  1. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
  2. DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
  3. El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  6. Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T–>G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
  7. Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
  8. Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
  9. Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
  10. Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 – Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
  11. Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
  12. Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
  13. Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
  14. Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
  15. Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3′ hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
  16. Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
  17. Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
  18. Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
  19. Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
  20. Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
  21. Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
  22. Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer’s disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
  23. Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
  24. Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
  25. Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
  26. Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington’s disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
  27. Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
  28. Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).

Play Video

Cite This Article
Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model. J. Vis. Exp. (181), e63452, doi:10.3791/63452 (2022).

View Video