Un approccio in vitro per studiare la disfunzione mitocondriale: un modello di cibridi
Summary
I cibridi transmitocondriali sono cellule ibride ottenute fondendo cellule impoverite di DNA mitocondriale (mtDNA) (cellule rho0 ) con citoplasti (cellule enucleate) derivati da pazienti affetti da disturbi mitocondriali. Consentono la determinazione dell’origine nucleare o mitocondriale della malattia, la valutazione dell’attività biochimica e la conferma del ruolo patogenetico delle varianti correlate al mtDNA.
Abstract
La carenza dei complessi della catena respiratoria mitocondriale che effettuano la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) è il marcatore biochimico dei disturbi mitocondriali umani. Da un punto di vista genetico, l’OXPHOS rappresenta un esempio unico perché deriva dalla complementazione di due sistemi genetici distinti: il DNA nucleare (nDNA) e il DNA mitocondriale (mtDNA). Pertanto, i difetti di OXPHOS possono essere dovuti a mutazioni che colpiscono i geni codificati nucleari e mitocondriali.
Il lavoro pionieristico di King e Attardi, pubblicato nel 1989, ha dimostrato che le linee cellulari umane impoverite di mtDNA (chiamato rho0) potrebbero essere ripopolate dai mitocondri esogeni per ottenere i cosiddetti “cibridi transmitocondriali”. Grazie a questi cibridi contenenti mitocondri derivati da pazienti con disturbi mitocondriali (MD) e nuclei da cellule rho0 , è possibile verificare se un difetto è correlato al mtDNA o all’nDNA. Questi cibridi sono anche un potente strumento per convalidare la patogenicità di una mutazione e studiarne l’impatto a livello biochimico. Questo documento presenta un protocollo dettagliato che descrive la generazione, la selezione e la caratterizzazione dei cibridi.
Introduction
I disturbi mitocondriali (MD) sono un gruppo di sindromi multisistemiche causate da una compromissione delle funzioni mitocondriali a causa di mutazioni nel DNA1 nucleare (nDNA) o mitocondriale (mtDNA). Sono tra le malattie metaboliche ereditarie più comuni, con una prevalenza di 1:5.000. Le malattie associate al mtDNA seguono le regole della genetica mitocondriale: ereditarietà materna, eteroplasmia ed effetto soglia e segregazione mitotica2. Il mtDNA umano è un cerchio di DNA a doppio filamento di 16,6 kb, che contiene una breve regione di controllo con sequenze necessarie per la replicazione e la trascrizione, 13 geni codificanti proteine (tutte le subunità della catena respiratoria), 22 tRNA e 2 geni rRNA3.
Negli individui sani, esiste un singolo genotipo di mtDNA (omoplasmia), mentre più di un genotipo coesiste (eteroplasmia) in condizioni patologiche. Le mutazioni eteroplasmatiche deleterie devono superare una soglia critica per interrompere OXPHOS e causare malattie che possono colpire qualsiasi organo a qualsiasi etàdi 4 anni. La duplice genetica di OXPHOS determina la trasmissione: autosomica recessiva o dominante e legata all’X per le mutazioni del nDNA, materna per le mutazioni del mtDNA, più casi sporadici sia per nDNA che per mtDNA.
All’inizio dell’era della medicina mitocondriale, un esperimento storico di King e Attardi5 ha stabilito le basi per comprendere l’origine di una mutazione responsabile di una MD creando cellule ibride contenenti nuclei da linee cellulari tumorali in cui il mtDNA era completamente impoverito (cellule rho0) e mitocondri da pazienti con MD. Tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) non erano disponibili in quel momento, e non è stato facile determinare se una mutazione fosse presente nel genoma nucleare o mitocondriale. Il metodo, descritto nel 1989, è stato poi utilizzato da diversi ricercatori che lavorano nel campo della medicina mitocondriale 6,7,8,9; un protocollo dettagliato è stato recentemente pubblicato10, ma nessun video è stato ancora realizzato. Perché un tale protocollo dovrebbe essere rilevante al giorno d’oggi quando NGS potrebbe identificare in modo preciso e rapido dove si trova una mutazione? La risposta è che la generazione di cibridi è ancora il protocollo all’avanguardia per comprendere il ruolo patogenetico di qualsiasi nuova mutazione del mtDNA, correlare la percentuale di eteroplasmia con la gravità della malattia ed eseguire un’indagine biochimica in un sistema nucleare omogeneo in cui il contributo del background nucleare autoctono del paziente è assente11, 12,13.
Questo protocollo descrive come ottenere citoplasti da fibroblasti confluenti derivati dal paziente coltivati in piastre di Petri da 35 mm. La centrifugazione delle piastre in presenza di citocalasina B consente l’isolamento di citoplasti enucleati, che vengono poi fusi con cellule rho0 in presenza di polietilenglicole (PEG). I cibridi risultanti vengono quindi coltivati in mezzo selettivo fino a quando non sorgono cloni. La sezione dei risultati rappresentativi mostra un esempio di caratterizzazione molecolare dei cibridi risultanti per dimostrare che il mtDNA è identico a quello dei fibroblasti dei pazienti donatori e che l’nDNA è identico al DNA nucleare della linea cellulare tumorale rho0 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Il mtDNA ha un tasso di mutazione molto elevato rispetto all’nDNA a causa della mancanza di istoni protettivi e della sua posizione vicino alla catena respiratoria, che espone la molecola a dannosi effetti ossidativi non efficacemente contrastati dai sistemi di riparazione16. Le prime mutazioni patogenetiche del mtDNA sono state identificate nel 198817,18 e da allora è stato descritto un gran numero di mutazioni. La tecnologia NGS è un a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato condotto nel Centro per lo Studio delle Malattie Mitocondriali Pediatriche (http://www.mitopedia.org), finanziato dalla Fondazione Mariani. VT è membro dell’European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
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