Uma abordagem in vitro para estudar disfunção mitocondrial: um modelo cibrid
Summary
Cibridos transmissocondriais são células híbridas obtidas pela fusão de DNA mitocondrial (mtDNA) células esgotadas (células rho0 ) com citoplastas (células enucleadas) derivadas de pacientes afetados por distúrbios mitocondriais. Permitem a determinação da origem nuclear ou mitocondrial da doença, avaliação da atividade bioquímica e confirmação do papel patogênico das variantes relacionadas ao MTDNA.
Abstract
Deficiência dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial que realizam fosforilação oxidativa (OXPHOS) é o marcador bioquímico das doenças mitocondriais humanas. Do ponto de vista genético, o OXPHOS representa um exemplo único porque resulta da complementação de dois sistemas genéticos distintos: DNA nuclear (nDNA) e DNA mitocondrial (mtDNA). Portanto, os defeitos oxphos podem ser devido a mutações que afetam genes codificados nucleares e mitocondriais.
O trabalho inovador de King e Attardi, publicado em 1989, mostrou que as linhas celulares humanas esgotadas de mtDNA (chamada rho0) poderiam ser repovoadas por mitocôndrias exógenas para obter os chamados “cibrids transmissores”. Graças a esses cibrids contendo mitocôndrias derivadas de pacientes com distúrbios mitocondriais (DM) e núcleos de células rho0 , é possível verificar se um defeito está relacionado com MTDNA ou nDNA. Esses cibrids também são uma ferramenta poderosa para validar a patogenicidade de uma mutação e estudar seu impacto a um nível bioquímico. Este artigo apresenta um protocolo detalhado descrevendo geração, seleção e caracterização cibrid.
Introduction
Os distúrbios mitocondriais (DM) são um grupo de síndromes multissistemas causadas por um comprometimento nas funções mitocondriais devido a mutaçõesno DNA nuclear (nDNA) ou mitocondrial (mtDNA). Estão entre as doenças metabólicas herdadas mais comuns, com prevalência de 1:5.000. as doenças associadas ao MTDNA seguem as regras da genética mitocondrial: herança materna, heteroplasma e efeito limiar, e segregação mitótica2. O mtDNA humano é um círculo de DNA de dupla rega de 16,6 kb, que contém uma região de controle curto com sequências necessárias para replicação e transcrição, 13 genes codificadores de proteínas (todas subunidades da cadeia respiratória), 22 tRNA e 2 genes rRNA3.
Em indivíduos saudáveis, há um único genótipo de MTDNA (homoplasma), enquanto mais de um genótipo coexiste (heteroplasma) em condições patológicas. Mutações heteroplasmáticas deletérias devem superar um limiar crítico para interromper o OXPHOS e causar doenças que podem afetar qualquer órgão a qualquer idade aos4 anos. A genética dupla do OXPHOS dita a herança: recessiva autossômica ou dominante e ligada a X para mutações de nDNA, materna para mutações de MTDNA, além de casos esporádicos tanto para nDNA quanto para dNA.
No início da era da medicina mitocondrial, um experimento marcante de King e Attardi5 estabeleceu a base para entender a origem de uma mutação responsável por um DM, criando células híbridas contendo núcleos de linhas de células tumorais nas quais o MTDNA estava totalmente esgotado (rho0 células) e mitocôndrias de pacientes com DM. Técnicas de sequenciamento de última geração (GNS) não estavam disponíveis naquela época, e não foi fácil determinar se uma mutação estava presente no genoma nuclear ou mitocondrial. O método, descrito em 1989, foi então utilizado por vários pesquisadores que atuam no campo da medicina mitocondrial 6,7,8,9; um protocolo detalhado foi publicado recentemente10, mas nenhum vídeo foi feito ainda. Por que tal protocolo deveria ser relevante hoje em dia quando o NGS poderia identificar com precisão e rapidez onde uma mutação está localizada? A resposta é que a geração cibrid ainda é o protocolo de última geração para entender o papel patogênico de qualquer nova mutação mtDNA, correlacionar a porcentagem de heteroplasma com a gravidade da doença, e realizar uma investigação bioquímica em um sistema nuclear homogêneo no qual a contribuição do fundo nuclear autóctono do paciente está ausente11, 12,13.
Este protocolo descreve como obter citoplastos de fibroblastos confluentes e derivados do paciente cultivados em placas de Petri de 35 mm. A centrifugação dos pratos na presença de citochalasina B permite o isolamento de citoplastos enucleados, que são então fundidos com células rho0 na presença de polietileno glicol (PEG). Os cibrids resultantes são então cultivados em meio seletivo até que os clones surjam. A seção de resultados representativos mostra um exemplo de caracterização molecular dos cibridos resultantes para provar que o mtDNA é idêntico ao dos fibroblastos dos pacientes doadores e que o nDNA é idêntico ao DNA nuclear da linha celular rho0 tumoral.
Protocol
Representative Results
Discussion
O mtDNA tem uma taxa de mutação muito alta em comparação com o NDNA devido à falta de histonas protetoras e sua localização perto da cadeia respiratória, o que expõe a molécula a efeitos oxidativos prejudiciais não neutralizados eficientemente pelos sistemas de reparo16. As primeiras mutações patogênicas de MTDNA foram identificadas em 198817,18 e, desde então, um grande número de mutações foram descritas. A tecnologia NG…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi realizado no Centro de Estudos de Doenças Pediátricas Mitocondriais (http://www.mitopedia.org), financiado pela Fundação Mariani. VT é membro da European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
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